黃芙萌，趙 莉，馬芳霞，陳 釗，王 莉，田李芳

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，陜西西安 710004)

硒(selenium, Se)是多種生物體內(nèi)不可缺少的微量元素。硒以硒蛋白形式在體內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)功能[1]。硒蛋白的特征為蛋白中都有硒代半胱氨酸(selenocysteine, Sec)，人體內(nèi)共有25種硒蛋白基因，編碼超過30種硒蛋白[2]。硒蛋白S(SelS)是硒蛋白家族的主要成員，具有抗氧化損傷，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，參與精子發(fā)育過程等多方面的生物學(xué)功能[3]。人類SelS基因位于15號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，其mRNA有2個(gè)轉(zhuǎn)錄變體，分別由1 250和1 292個(gè)堿基組成，它們均能編碼由189個(gè)氨基酸殘基組成的 SelS，其中第188位為Sec殘基，是肽鏈中倒數(shù)第2位的氨基酸[4]。

Se元素以Sec的形式插入硒蛋白，此過程需要一個(gè)能將mRNA中的UGA密碼子翻譯成Sec的特殊機(jī)制，在硒蛋白mRNA 3′端非翻譯區(qū)域(3′TUR)中存在一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence, SECIS)，該結(jié)構(gòu)在翻譯過程中能使絲氨酰-tRNA上的反密碼子ACU與密碼子UGA交錯(cuò)配對(duì)[5]。在Sec特異性延長(zhǎng)因子、SECIS結(jié)合蛋白2(SECIS binding protein 2, SBP2)、核糖體蛋白L30、RNA結(jié)合蛋白、可溶性肝臟抗原蛋白和硒磷酸合酶1的輔助下，將Sec-tRNASec上攜帶的Sec插入到硒蛋白肽鏈中[6]。

硒蛋白作為機(jī)體內(nèi)硒的最主要代謝形式，在硒缺乏與否的情況下存在兩種剪接方式：一種是將UGA翻譯為Sec插入硒蛋白肽鏈中，另一種是UGA作為終止密碼子終止硒蛋白肽鏈的翻譯。后者發(fā)生在細(xì)胞環(huán)境中缺乏合成原料硒時(shí)，硒蛋白的合成受到限制，而選擇將UGA作為終止密碼子終止硒蛋白肽鏈的翻譯，不再插入Sec，形成羧基端缺失-Sec-Gly、無(wú)酶活性、截短的硒蛋白[7]。

本研究將模擬硒缺乏環(huán)境，構(gòu)建能翻譯出截短 SelS的重組質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建其具有正常生物活性的全長(zhǎng) SelS的重組質(zhì)粒，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以期觀察硒蛋白S截短體和完整形式在細(xì)胞系或動(dòng)物體內(nèi)高表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)在西安交通大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室完成。pEGFP-C1真核表達(dá)載體、人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞系及DH5α大腸桿菌菌種由本實(shí)驗(yàn)室留存。高保真Taq酶及DNA marker購(gòu)于日本TaKaRa公司，PCR primers由北京三博志遠(yuǎn)公司合成，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit、ApaⅠ酶及XhoⅠ酶購(gòu)于加拿大Fermentas公司，Gel Extraction System B VER2.0試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，T4 DNA連接酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)公司，胰蛋白胨及酵母提取物購(gòu)于英國(guó)Oxoid公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾生物試劑，胎牛血清及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，Lipofectamine 2000及Trizol?Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，E.Z.N.A. Fastfilter Endo-Free Plasmia Midi Kit購(gòu)于OMEGA生物技術(shù)公司，6孔板購(gòu)于美國(guó)Corning公司，倒置相差顯微鏡及正置熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀(FACS)購(gòu)于美國(guó)Guava Technologies公司。

1.2 SelS基因PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 截短的SelS用trun-S表示。trun-S中PCR的目的基因片段為CDS部分，不包括5′UTR或者3′TUR；全長(zhǎng)SelS中PCR的目的基因片段為CDS+3′TUR部分，不包括5′UTR，3′TUR中含有SECIS序列。設(shè)計(jì)引物時(shí)，先在GenBank上查找出基因序列GenBank No.NM_018445.4，然后利用PRIMER-v5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)好之后在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST 進(jìn)行查詢，確定與其他基因無(wú)同源性，為特異性序列。設(shè)計(jì)時(shí)引物的上下游分別引入與載體相應(yīng)的內(nèi)切酶位點(diǎn)，上游用核酸內(nèi)切酶XhoⅠ，其識(shí)別序列為CTCGAG，下游用核酸內(nèi)切酶ApaⅠ，其識(shí)別序列為GGGCCC。PCR引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成(表1)。

表1 硒蛋白PCR引物信息

Tab.1 Primer information of selenoproteins

基因引物序列(5'～3')擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp)退火溫度(℃)SelS正義鏈CCGCTCGAGATGGAACGCCAAGAGG反義鏈GCGGGCCCTTAATATACAGAAACAAACCCCATC103460trun-SelS正義鏈CCGCTCGAGATGGAACGCCAAGAGGAGTC反義鏈GCGGGCCCTTAGCCTCATCCGCCAG58759

1.3 表達(dá)載體的選擇 在表達(dá)載體pEGFP-C1的多克隆酶切位點(diǎn)上，選擇與SelS基因兩端對(duì)應(yīng)的核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)XhoⅠ及ApaⅠ，兩酶切位點(diǎn)之間的序列將被切除，插入本研究的目的SelS基因片段(圖1)。

圖1 pEGFP-C1載體結(jié)構(gòu)和多克隆位點(diǎn)示意圖

Fig.1 Schematic diagram of pEGFP-C1and its multiple cloning site

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 建立PCR反應(yīng)體系：5×Taq酶buffer 10 μL，正義鏈引物P1 1 μL，反義鏈引物P2 1 μL，模板0.5 μL，高保真Taq酶0.5 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 33 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 45 s，退火溫度45 s，72 ℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)后，72 ℃ 10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳確定DNA大小為目的條帶并且無(wú)其他雜帶。

用Gel Extraction System B VER2.0試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。建立50 μL雙酶切目的DNA片段的反應(yīng)體系：XhoⅠ 2 μL，ApaⅠ 2 μL，10×Tango buffer 5 μL，DNA片段20 μL，H2O 21 μL；建立40 μL雙酶切載體的反應(yīng)體系：XhoⅠ 1.6 μL，ApaⅠ 1.6 μL，10×Tango buffer 4 μL，DNA片段10 μL，H2O 22.8 μL。分別于37 ℃水浴6 h。將雙酶切獲取的目的DNA片段和載體按照上述的膠回收方法回收。建立20 μL連接反應(yīng)體系：DNA片段8 μL，載體4 μL，T4 DNA連接酶1 μL，10×連接buffer 2 μL，H2O 5 μL，于16 ℃水浴連接過夜。

1.5 轉(zhuǎn)化及克隆的鑒定 常規(guī)方法制備感受態(tài)DH5α大腸桿菌，將5 μL連接產(chǎn)物加入200 μL感受態(tài)細(xì)胞過夜培養(yǎng)。第2天用滅菌牙簽挑起LB平板上長(zhǎng)出的單克隆菌落，移至5 mL LB培養(yǎng)液(含卡納霉素)中，37 ℃搖菌過夜。存菌種1 mL。用TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒提取擴(kuò)增好的質(zhì)粒，進(jìn)一步做目的硒蛋白基因的PCR擴(kuò)增，再用瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定重組質(zhì)粒中目的硒蛋白基因的轉(zhuǎn)入情況。將已存的500 μL菌液送去公司測(cè)序。將測(cè)序返回的結(jié)果輸入NCBI的BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)。

1.6 轉(zhuǎn)染表達(dá)及效率檢測(cè) DMEM高糖培養(yǎng)基加100 mL/L胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)將實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為4組，分別為Mock組、空載體對(duì)照組、trun-SelS組、SelS組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，整個(gè)實(shí)驗(yàn)共計(jì)12孔。6孔板中每孔接種2×105個(gè)懸浮在2 mL培養(yǎng)液中的細(xì)胞，接種24 h后細(xì)胞完全貼壁，當(dāng)細(xì)胞融合度約80%時(shí)，每孔加入2 mL不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；取無(wú)菌EP管1個(gè)，分別加入脂質(zhì)體5 μL和質(zhì)粒DNA 2 μg，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，使之總體積為500 μL，混勻后37 ℃孵育20 min后加入每孔細(xì)胞中，5 h后吸出培養(yǎng)液棄掉，每孔加入2 mL DMEM高糖培養(yǎng)基和100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后數(shù)小時(shí)，將6孔板直接放在倒置熒光顯微鏡下觀察，能觀察到綠色熒光與目的基因的融合蛋白開始表達(dá)，轉(zhuǎn)染后24 h后，用2.5 g/L胰酶消化細(xì)胞，PBS重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度大約為5×105/mL左右，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.7 目的基因表達(dá)的鑒定 Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA。在微量核酸/蛋白定量?jī)x上定量，10 g/L瓊脂糖凝膠鑒定質(zhì)量。按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將提取的總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以此為模板，用上述PCR體系對(duì)所轉(zhuǎn)染的硒蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，并10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 SelS基因克隆的鑒定結(jié)果 構(gòu)建了SelS和trun-SelS基因的克隆，瓊脂糖電泳凝膠圖顯示(圖2)，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，均釋放出了與目的硒蛋白DNA片段大小一致的DNA片段和載體pEGFP-C1，與測(cè)序結(jié)果的BLAST比對(duì)并確定插入片段堿基無(wú)缺失、無(wú)插入、無(wú)突變，一致率為100%，說(shuō)明目的克隆已被成功構(gòu)建。

圖2 SelS和trun-SelS基因重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmids of selenoprotein S genes

M：DNA marker(D2000)；1：trun-SelS的PCR產(chǎn)物；2：trun-SelS重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；3：為SelS的PCR產(chǎn)物；4：SelS重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。

2.2 轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染trun-SelS和SelS 24 h后，綠色熒光蛋白表達(dá)很好(圖3)，將細(xì)胞消化后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40%以上。這說(shuō)明目的蛋白成功表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)染24 h時(shí)RT-PCR檢測(cè)目的硒蛋白基因的表達(dá)情況 trun-SelS組和SelS組的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果都出現(xiàn)了明顯的trun-SelS基因條帶，而mock組和空載體組由于目的基因拷貝數(shù)低，沒有出現(xiàn)明顯的目的條帶，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功，即被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞高表達(dá)了trun-SelS基因；由于SelS的基因片段中包含trun-SelS基因片段，所以在SelS組中也有trun-SelS基因片段的高表達(dá)；由于trun-SelS的基因片段中沒有完全包含SelS基因片段，所以PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果只有SelS組高表達(dá)了SelS目的基因，也說(shuō)明了SelS組重組質(zhì)粒的成功轉(zhuǎn)染；4組PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)了明顯的內(nèi)參基因條帶，且灰度基本一致，說(shuō)明4組12個(gè)樣品的均一性很好，比較是有意義的，結(jié)果真實(shí)可靠(圖4)。

圖3 硒蛋白S截短和全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞24 h綠色熒光蛋白的表達(dá)

Fig.3 GFP expression of normal and truncated selenoprotein S genes at 24 hours after transfection into Hela cells

A：細(xì)胞在光鏡下形態(tài)；B：細(xì)胞在熒光顯微鏡下形態(tài)及綠色熒光蛋白的表達(dá)。

這說(shuō)明已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染了SelS截短和正常的基因構(gòu)建體，并使目的基因在細(xì)胞系中得以高表達(dá)，可進(jìn)一步觀察這些目的基因高表達(dá)后對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)作用。

3 討 論

綠色熒光蛋白由于其易表達(dá)、分子質(zhì)量小、蛋白穩(wěn)定及對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn), 是近年來(lái)在分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記性蛋白質(zhì)之一。綠色熒光真核表達(dá)載體pEGFP-C1作為改良后的一種變體，更易于觀測(cè)和研究目的基因的表達(dá)、調(diào)控及其目的蛋白在生物體內(nèi)定位和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

應(yīng)用此載體，我們成功構(gòu)建了SelS截短和正常的基因重組質(zhì)粒，截短體基因只包含mRNA的CDS，全長(zhǎng)包括mRNA的CDS和3′UTR序列。在硒蛋白mRNA的3′TUR中存在SECIS，該結(jié)構(gòu)在翻譯過程中能將UGA翻譯為Sec，硒蛋白中的硒都以Sec位于活性中心發(fā)揮其生物學(xué)作用[2]。所以，存在3′TUR的硒蛋白基因?qū)⒈磉_(dá)出正常的有酶活性的SelS，而僅含CDS序列的硒蛋白基因?qū)⒈磉_(dá)出羧基端缺失-Sec-Gly的無(wú)酶活性的截短SelS。

圖4 轉(zhuǎn)染硒蛋白S截短和全長(zhǎng)基因后RT-PCR產(chǎn)物的的電泳結(jié)果

Fig.4 RT-PCR results of normal and truncated selenoprotein S genes after plasmid transfection

A圖中1～3：mock組；4～6：空載體組；7～9：trun-SelS組；10～12：SelS組；每組中設(shè)3個(gè)平行樣；B：內(nèi)參GAPDH。

ABESTAL[8]做了有關(guān)截短硒蛋白的研究：利用化學(xué)技術(shù)去除掉蛋白質(zhì)肽鏈上最后兩個(gè)氨基酸-Sec-Gly，制作出截短的硒蛋白，然后測(cè)定其酶活性，發(fā)現(xiàn)截短硫氧還蛋白還原酶1(TrxR1)的自身酶活性與正常全長(zhǎng)相比非常低，幾乎檢測(cè)不到，硒含量也接近無(wú)。研究者利用BioPORTER技術(shù)將這種截短的硒蛋白導(dǎo)入A549細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其與具有正常酶活性TrxR1蛋白比較能引起細(xì)胞快速死亡，但機(jī)制不清[8]。此研究結(jié)果引起我們極大的興趣。日本學(xué)者又研究了TrxR2的剪接體，在其cDNA水平上編碼區(qū)有3個(gè)堿基的缺失、終止密碼子與3′UTR的SECIS之間有1228個(gè)堿基的插入。為了檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)的功能，他們將此種截短的TrxR2剪接體轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞系中并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，表達(dá)出的截短的TrxR2能引起細(xì)胞凋亡，凋亡原因?yàn)镹ADPH的還原和細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高。此研究說(shuō)明截短的硒蛋白在細(xì)胞生理病理中起著特殊的調(diào)節(jié)作用[9]。

鑒于SelS在機(jī)體內(nèi)豐富的表達(dá)并有其重要的生物學(xué)功能，迄今為止還沒有研究通過基因重組將SelS的不同剪接體形式在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而本研究通過將這兩種SelS的重組質(zhì)粒在靶細(xì)胞中表達(dá)，以便模擬正常和硒缺乏狀態(tài)下硒蛋白在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)，為進(jìn)一步研究低硒或缺硒疾病的致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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