任文娟，師娟子，李明昭，張四林，薛 俠，趙皖秋，洪慧慧，周黨俠

(1. 西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，陜西西安 710061；2. 西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，陜西西安 710003)

近年來(lái)，隨著輔助生殖技術(shù)的飛速發(fā)展，通過(guò)輔助生殖技術(shù)助孕的夫婦數(shù)量逐年增加，而如何提高臨床妊娠率、種植率，降低流產(chǎn)率，并最終生育一個(gè)健康活產(chǎn)兒，一直是試管技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的核心方向。首先，隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)的穩(wěn)定發(fā)展，移植囊胚甚至是移植一枚優(yōu)質(zhì)的單囊胚已經(jīng)成為趨勢(shì)。體外囊胚培養(yǎng)的過(guò)程，會(huì)自然淘汰一些無(wú)發(fā)育潛能的胚胎，同時(shí)囊胚移植與子宮內(nèi)膜更加同步。相較胚胎移植，囊胚移植能顯著降低異位妊娠率，并可提高種植率和妊娠率[1]。選擇一枚級(jí)別最高的單囊胚進(jìn)行移植，可以降低多胎率，減少妊娠并發(fā)癥、降低早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，提高活產(chǎn)率，而將其余的囊胚冷凍，也能夠提高累積妊娠率。有研究報(bào)道，冷凍囊胚比新鮮囊胚移植成功率更高[2]。但是，囊胚腔內(nèi)含較多液體，在冷凍技術(shù)過(guò)程中，容易產(chǎn)生冰晶，一定程度的損傷囊胚。

因此，本研究采用不同的預(yù)處理方法，對(duì)我中心3 859例囊胚培養(yǎng)成功并進(jìn)行玻璃化冷凍的臨床資料和結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，旨在探討囊胚激光人工皺縮預(yù)處理方法(laser artificial shrinkage method, LAS)對(duì)囊胚凍融的復(fù)蘇率、移植后的臨床妊娠率和種植率的影響，及其在年齡<36歲和≥36歲囊胚玻璃化凍融中的應(yīng)用效果。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年1月1日至2015年12月31日期間，在西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心接受體外受精(in-vitrofertilization, IVF)及卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)治療的患者行解凍囊胚周期3 859例。解凍囊胚為新鮮周期移植后剩余胚胎培養(yǎng)成的囊胚，以及因預(yù)防卵巢過(guò)度刺激癥(ovarian hyper-stimulation syndrome, OHSS)等原因取消移植后冷凍保存的囊胚，所有患者均了解本研究的目的并簽署知情同意書(shū)。本研究分析激光皺縮在囊胚玻璃化冷凍中的價(jià)值，相關(guān)數(shù)據(jù)來(lái)源及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)均得到醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 超促排卵方案與胚胎評(píng)估 選取周期均采用短效長(zhǎng)方案：降調(diào)節(jié)藥物為醋酸曲普瑞林(0.1 mg/d，達(dá)必佳，德國(guó)輝凌)，從黃體中期開(kāi)始給予降調(diào)節(jié)，14 d 后測(cè)血清卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、雌激素(estradiol, E2)及黃體生成素(luteinizing hormone, LH)，待達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)(FSH<5 U/L，E2<183 pmol/L，LH<5 U/L)后，使用重組人促卵泡素果納芬(75 IU/支，瑞士雪蘭諾)150～300 IU/d促排卵，當(dāng)17～18 mm卵泡數(shù)占≥14 mm卵泡數(shù)60%～70%時(shí)，注射5 000～10 000 U人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG，珠海麗珠)，36 h后行陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。根據(jù)精子情況采用常規(guī)IVF或ICSI授精，次日晨觀察受精情況，第3天觀察胚胎發(fā)育情況[3]。

按Peter卵裂期胚胎評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估Day3胚胎質(zhì)量[4]。Ⅰ級(jí)：卵裂球大小均勻，形狀規(guī)則，透亮，碎片<10%；Ⅱ級(jí):卵裂球稍不均勻或形狀稍不規(guī)則，胞質(zhì)有顆粒現(xiàn)象，碎片在10%～20%之間；Ⅲ級(jí)：卵裂球明顯不均勻或形狀明顯不規(guī)則，胞質(zhì)有顆粒現(xiàn)象，碎片在20%～50%之間；Ⅳ級(jí)：卵裂球嚴(yán)重不均勻或形狀嚴(yán)重不規(guī)則，胞漿有顆?，F(xiàn)象，碎片>50%。將第3天Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ～Ⅲ級(jí)為可用胚胎。再根據(jù)胚胎和患者情況決定第3天或第5天移植，第3天移植或冷凍后剩余的以及預(yù)防OHSS等取消ET的胚胎，經(jīng)患者知情同意后，培養(yǎng)至第6天。采用Gardner的評(píng)分方法對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)分[5]，將符合冷凍標(biāo)準(zhǔn)的囊胚進(jìn)行冷凍保存。根據(jù)Garnder囊胚分級(jí)法對(duì)形成的囊胚進(jìn)行分級(jí)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：A級(jí)，細(xì)胞數(shù)量多，結(jié)合緊密；B級(jí)，細(xì)胞數(shù)目少，結(jié)合較松散；C級(jí)，細(xì)胞數(shù)目極少；將第5～6天形成的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞在B、C級(jí)以上的擴(kuò)張期囊胚冷凍保存[6]。

1.2.2 激光打孔輔助囊胚皺縮 將3 859例解凍囊胚周期根據(jù)是否進(jìn)行激光人工皺縮分為激光皺縮組和未皺縮組，進(jìn)一步根據(jù)年齡分為2個(gè)亞組：<36歲組和≥36歲組。參照LANDUYT等[7]報(bào)道的方法人工皺縮囊胚腔。將待冷凍的囊胚置于37 ℃操作臺(tái)上，選擇遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)且滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞較稀疏的位置使用激光破囊腔，將待冷凍的擴(kuò)張期囊胚置于倒置顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti-S)熱臺(tái)上，該顯微鏡安裝有ZILOS-tk激光系統(tǒng)(美國(guó)Hamiltoon Thorne Biosciences)。采用激光能量400～800 J，在遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)且滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)較稀疏的細(xì)胞連接處燒灼出一個(gè)5～10 μm的破口，使囊腔液流出，觀察到囊胚腔塌陷皺縮后冷凍[8]。

1.2.3 囊胚玻璃化冷凍、解凍與囊胚移植 我中心采用Vitrification試劑盒(Kitazato, Japan)進(jìn)行玻璃化冷凍及解凍。冷凍過(guò)程：將待冷凍囊胚在ES液中室溫放置10～12 min，觀察細(xì)胞擴(kuò)張至原體積80%以上，轉(zhuǎn)入VS液中，在1 min內(nèi)裝載到標(biāo)記患者詳細(xì)信息的冷凍載桿上，并迅速投入液氮裝上套管。解凍過(guò)程：將待解凍載桿迅速?gòu)囊旱腥〕龇湃胩崆?7 ℃預(yù)熱的解凍1液(TS液)中，計(jì)時(shí)1 min，依次轉(zhuǎn)移至2(DS液)、3(WS1)、4液(WS2)，分別計(jì)時(shí)3、5、

5 min，最后轉(zhuǎn)移至預(yù)平衡好的FET-G2皿(Vitrolife, Swedish)中，觀察囊胚復(fù)蘇成活與否，并在三氣培養(yǎng)箱中(Labtech)培養(yǎng)2 h以上，囊胚重新擴(kuò)張到具有正常內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層形態(tài)視為存活并移植。復(fù)蘇成活囊胚數(shù)/解凍囊胚數(shù)為復(fù)蘇率。

1.2.4 FET周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備與妊娠結(jié)局評(píng)價(jià)指標(biāo) 根據(jù)月經(jīng)及內(nèi)膜情況采用：①自然周期，月經(jīng)規(guī)律能自然排卵者，在月經(jīng)第8天開(kāi)始監(jiān)測(cè)卵泡，排卵后第5天，排卵日子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，行囊胚移植；②人工周期，月經(jīng)第5天口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè)，德國(guó)拜耳)4～6 mg/d，用藥8～10 d，當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，注射黃體酮(20 mg/支，浙江仙琚)60 mg/d，注射第7天行B超引導(dǎo)下囊胚移植。移植后給予黃體支持，黃體酮60 mg/d，地屈孕酮20 mg/d，移植后第12天檢測(cè)血hCG，陽(yáng)性者為生化妊娠，移植后35 d B超檢查可見(jiàn)孕囊為臨床妊娠。孕12周內(nèi)妊娠丟失為早期流產(chǎn)。成功種植的孕囊數(shù)/移植囊胚數(shù)為種植率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，采用χ2檢驗(yàn)；理論頻數(shù)小于5用FISH確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者的基本情況比較 <36歲激光皺縮組和未皺縮組，≥36歲激光皺縮組和未皺縮組的平均移植囊胚數(shù)[(1.72±0.47vs. 1.72±0.48)，(1.71±0.47vs.1.73±0.50)]、平均年齡[(28.88±3.11vs. 29.15±3.16)，(38.03±1.93vs. 38.06±2.25)]均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。激光皺縮組、<36歲激光皺縮組、≥36歲激光皺縮組的復(fù)蘇率分別為97.32%、97.27%、97.75%，均高于未皺縮組95.13%、95.33%、93.66%，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=16.264,χ2=11.411，χ2=5.148，P<0.05)。激光皺縮組解凍移植后取消率(0.19%vs. 0.29%)略低于未皺縮組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1、2)。

表1 激光皺縮組和未皺縮組患者基本情況的比較

Tab.1 Comparison of basic parameters between LAS group and non-LAS group

指標(biāo)激光皺縮組未皺縮組P解凍周期數(shù)(n)3176683移植周期數(shù)(n)3170681取消周期率 (%)6/31760.192/6830.29 0.938χ2=0.006復(fù)蘇率 (%)5453/560397.321173/123395.13 <0.001χ2=16.264年齡(歲)29.83±4.1020～46歲30.15±4.1721～45歲 0.061t=-1.875平均移植胚胎數(shù)1.72±0.471.72±0.48 0.896t=0.130

表2 <36歲組和≥36歲組間基本情況的比較

Tab.2 Comparison of basic parameters between <36 y subgroup and ≥36 y subgroup

指標(biāo)激光皺縮組<36歲≥36歲未皺縮組<36歲≥36歲P<36歲≥36歲解凍周期數(shù)(n)284533160677移植周期數(shù)(n)284033060477取消周期率(%)復(fù)蘇率 (%)0.184887/502497.270.30566/57997.750.331040/109195.330133/14293.660.788χ2=0.0730.001χ2=11.4111.0000.023χ2=5.148年齡(歲)28.88±3.1120～35歲38.03±1.9336～46歲29.15±3.1621～35歲38.06±2.2536～45歲0.053t=-1.9870.900t=-0.126平均移植胚胎數(shù)1.72±0.471.71±0.471.72±0.481.73±0.500.974t=-0.0330.762t=-0.303

2.2 激光皺縮組和未皺縮組妊娠結(jié)局的比較 激光皺縮組的臨床妊娠率、種植率分別為66.81%、53.55%，未皺縮組的臨床妊娠率、種植率分別為62.70%、49.74%，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。激光皺縮組的生化妊娠率(71.55%vs. 67.99%)高于未皺縮組，早期流產(chǎn)率(11.24%vs. 11.71%)略低于未皺縮組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；<36歲激光皺縮組生化妊娠率(72.25%vs. 70.20%)、臨床妊娠率(67.82%vs. 64.57%)、種植率(54.45%vs. 51.40%)均高于<36歲未皺縮組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?！?6歲激光皺縮組臨床妊娠率(58.18%vs. 48.05%)、種植率(45.74%vs. 36.84%)均高于≥36歲未皺縮組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而≥36歲激光皺縮組生化妊娠率(65.45%vs. 50.65%)高于≥36歲未皺縮組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.848，P<0.05)(表3、4)。

表3 激光皺縮組和未皺縮組妊娠結(jié)局的比較

Tab.3 Comparison of pregnancy outcome between LAS group and non-LAS group (%)

指標(biāo)激光皺縮組未皺縮組P生化妊娠率 (%)2268/317071.55463/68167.990.064χ2=3.440臨床妊娠率 (%)2118/317066.81427/68162.700.040χ2=4.229種植率 (%)2912/543853.55582/117049.740.018χ2=5.596早期流產(chǎn)率 (%)238/211811.2450/42711.710.779χ2=0.079

3 討 論

囊胚培養(yǎng)最重要的作用就是篩選具有更高潛能的胚胎，有助于淘汰第3天形態(tài)學(xué)評(píng)分高但發(fā)育阻滯的胚胎，且避免第3天形態(tài)學(xué)評(píng)分低但有發(fā)育潛能的胚胎被丟棄。ZECH等[9]研究認(rèn)為，單囊胚移植的種植率顯著高于卵裂期胚胎。因此，囊胚培養(yǎng)有利于提高種植率，控制多胎率。囊胚的細(xì)胞較小，細(xì)胞數(shù)目多，尤其是滋養(yǎng)細(xì)胞層細(xì)胞損傷后修復(fù)能力強(qiáng)，少數(shù)細(xì)胞死亡后對(duì)胚胎發(fā)育能力影響小而且囊胚移植與子宮內(nèi)膜的發(fā)育更同步[10]。因此，我中心有大量周期培養(yǎng)囊胚并冷凍，行解凍后移植，臨床妊娠率66.09%，比同期新鮮及解凍胚胎移植臨床妊娠率高(53.48%、59.24%)。

表4 <36歲組和≥36歲組間妊娠結(jié)局的比較

Tab.4 Comparison of pregnancy outcome between <36 y subgroup and ≥36 y subgroup

指標(biāo)激光皺縮組<36歲≥36歲未皺縮組<36歲≥36歲P<36歲≥36歲生化妊娠率 (%)2052/284072.25216/33065.45424/60470.2039/7750.650.308χ2=1.0410.016χ2=5.848臨床妊娠率 (%)1926/284067.82192/33058.18390/60464.5737/7748.050.123χ2=2.3850.107χ2=2.603種植率 (%)2654/487454.45258/56445.74533/103751.4049/13336.840.073χ2=3.2100.063χ2=3.461早期流產(chǎn)率 (%)200/192610.3838/19219.7940/39010.2610/3727.030.940χ2=0.0060.332χ2=0.980

冷凍技術(shù)是生殖中心不可缺少的核心技術(shù)之一。培養(yǎng)囊胚后冷凍保存，常適用于以下幾種情況：第3天胚胎移植后，剩余低級(jí)別胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，養(yǎng)成囊胚冷凍；優(yōu)質(zhì)胚胎多于4個(gè)，且可用胚胎在8個(gè)以上，經(jīng)患者同意，培養(yǎng)至第5天，養(yǎng)成囊胚擇優(yōu)移植，對(duì)剩余的囊胚冷凍保存；若因OHSS風(fēng)險(xiǎn)、P值高及其他原因?qū)е氯∠浦?，可培養(yǎng)囊胚后冷凍保存。

玻璃化冷凍操作時(shí)間短，對(duì)囊胚的冷凍保存比程序冷凍法有更高的復(fù)蘇率(90%以上)，因而被大多數(shù)中心應(yīng)用[10]。囊胚冷凍的效果比卵裂期胚胎差,影響囊胚冷凍復(fù)蘇效果最重要的原因就是囊胚腔的存在。冷凍過(guò)程中，冷凍保護(hù)劑需要充分置換細(xì)胞內(nèi)及囊腔內(nèi)的水分，就必須穿透滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)外兩層細(xì)胞膜進(jìn)入囊胚腔，其中的水分同樣要穿透滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)外兩層細(xì)胞膜滲出到囊胚外，所以很難充分脫水并避免冰晶形成對(duì)囊胚的損傷。而腔內(nèi)水分越多，冷凍保護(hù)劑滲透越不充分，而產(chǎn)生冰晶。有研究表明，擴(kuò)張囊胚比早期囊胚的玻璃化冷凍效果差，特別是囊胚發(fā)育到Gardner 4期后，其內(nèi)含大量的液體[11-12]。

為了解決囊胚腔存在影響冷凍復(fù)蘇效果的問(wèn)題，大量學(xué)者探索人工皺縮的方法，有注射針抽吸法，拉細(xì)管吹打法，激光法以及酶法等。其中激光法效果好損傷小且操作方便等優(yōu)點(diǎn)為最佳[13]。LANDUYT等[14]前瞻性隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)提示，激光皺縮可提高復(fù)蘇率。本研究得到一致結(jié)論，皺縮組以及<36歲和≥36歲兩個(gè)亞組間復(fù)蘇率均高于未皺縮組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究表明，囊胚冷凍前采用激光皺縮還能降低流產(chǎn)率[8]。而本研究統(tǒng)計(jì)早期流產(chǎn)率低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與PAOLO EMANUELE LEVI-SETTI[15]的報(bào)道相一致。 龐敏等[16]研究也提示流產(chǎn)率比對(duì)照組低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示人工皺縮囊胚腔未明顯影響子代的安全，但不排除對(duì)子代存在著遠(yuǎn)期危害的可能性。

雖然未皺縮組囊胚冷凍后的復(fù)蘇率在95%以上，但比皺縮組97.32%低，說(shuō)明在凍融過(guò)程中囊腔液脫水不充分而產(chǎn)生的冰晶可能使細(xì)胞受到損傷，胚胎復(fù)蘇還是受到了不同程度的影響。激光皺縮使囊腔塌陷，可以顯著提高囊胚的冷凍效果。若不經(jīng)人工皺縮冷凍，通過(guò)延長(zhǎng)冷凍時(shí)間或提高冷凍保護(hù)劑濃度的方法來(lái)防止囊胚內(nèi)冰晶的形成。高濃度冷凍保護(hù)劑和囊胚接觸時(shí)間越長(zhǎng)，越可能加重冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性損傷。

PAOLO EMANUELE LEVI-SETTI等[15]及馮貴雪等[17]的研究提示種植率、臨床妊娠率均高于未皺縮的囊胚組，本研究皺縮組與其結(jié)論一致，但<36歲和≥36歲兩個(gè)亞組間種植率、臨床妊娠率均高于未皺縮組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而≥36歲亞組生化妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。需要注意的是，雖然≥36歲亞組間臨床妊娠率和種植率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但皺縮組使高齡組臨床妊娠率能達(dá)到58.18%，種植率能達(dá)到45.74%，較未皺縮組高約10%，且生化妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示采用激光皺縮可能很好的改善玻璃化凍融后高齡人群囊胚的發(fā)育潛能,提高妊娠率。但可能是未皺縮組樣本量的不足，待以后增加樣本再統(tǒng)計(jì)。

綜上所述，囊胚冷凍前采用激光人工皺縮，通過(guò)釋放囊腔液使囊胚腔塌陷，減少其中的液體在凍融過(guò)程中形成冰晶產(chǎn)生細(xì)胞損傷而引起的不良影響，可提高解凍后的復(fù)蘇率、臨床妊娠率、種植率以及高齡(≥36歲)生化妊娠率，激光人工皺縮技術(shù)未明顯影響早期流產(chǎn)率，但不排除對(duì)后期的產(chǎn)科結(jié)局甚至子代產(chǎn)生危害的可能。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該技術(shù)的新生兒隨訪工作。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室的胚胎學(xué)家們應(yīng)嚴(yán)格技術(shù)操作，根據(jù)不同囊胚細(xì)胞在冷凍液中重新擴(kuò)張的時(shí)間來(lái)控制上架時(shí)間，盡量縮短與冷凍保護(hù)劑接觸時(shí)間，選擇質(zhì)量控制好的冷凍保護(hù)劑，減少對(duì)囊胚過(guò)多的操作和在培養(yǎng)箱外停留的時(shí)間，已獲得理想的臨床結(jié)局。

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