臧艷艷，柴文戍，王君靈，張慧云，楊蕊銘，何韶衡

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院：1. 變態(tài)反應與臨床免疫研究中心；2. 呼吸內(nèi)科，遼寧錦州 121001)

過敏性哮喘是一種以肺組織細胞浸潤(主要為嗜酸粒細胞及T細胞)、黏液過度分泌以及氣道高反應性為特征的小氣道炎癥性疾病。過敏性鼻炎，為上呼吸道過敏性疾病，成人鼻炎更易發(fā)展為哮喘[1]。目前的研究認為，嗜酸性粒細胞等炎癥細胞浸潤是過敏性鼻炎和哮喘共同的病理生理學基礎[2]。

P物質(zhì)(substance P, SP)源于神經(jīng)組織，是一種神經(jīng)肽，人體的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞均可分泌SP[3]。研究發(fā)現(xiàn)，過敏性鼻炎患者血漿和哮喘鼠模型肺泡灌洗液的SP濃度均顯著升高[4]，SP可通過直接活化其受體誘導鼻炎患者鼻黏膜充血、釋放組胺，提示SP可能參與過敏性氣道疾病。此外，SP可誘導過敏性鼻炎患者的鼻黏膜分泌趨化因子RANTES，促進嗜酸性粒細胞趨化和遷移，誘導和加重過敏性炎癥反應[5]，進一步提示SP可能通過嗜酸性粒細胞參與過敏性氣道疾病。SP主要通過其高親和力NK1受體(neurokinin 1 receptor, NK1R)在炎癥、呼吸和記憶方面發(fā)揮重要作用[6]。有報道稱哮喘患者氣道上皮細胞SP和NK1R均表達增加，NK1R阻斷劑可顯著改善哮喘鼠的過敏炎癥反應[7]，提示SP可能通過NK1R參與過敏性氣道疾病的發(fā)生。

近年來人們對SP和NK1R在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的表達和作用進行了深入研究[8-11]，但是SP和NK1R在呼吸疾病尤其是過敏性鼻炎合并哮喘(allergic rhinitis complicated with asthma, AR+AS)患者外周血嗜酸性粒細胞中的表達水平還未見相關報道。因此，本實驗應用流式細胞術檢測AR+AS患者外周血經(jīng)不同過敏原刺激后嗜酸性粒細胞群中SP和NK1R的表達變化，探討其在疾病發(fā)生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 BV421耦合的鼠抗人CCR3抗體、Zombie Aqua Fixable Viability kit(死細胞去除染料)、Fc受體(FcR)阻斷劑、紅細胞裂解液、高爾基受體阻斷劑(BFA)購自Biolegend(San Diego, CA, USA)；APC耦合的鼠抗人NK1R抗體、APC耦合的鼠IgG3同型抗體購自R&D Systems(Minneapolis, USA)；FITC耦合的兔抗人SP抗體購自Lifespan (Rochester, NY, USA)；FITC耦合的兔IgG同型抗體購自eBioscienceLos (Angeles, CA, USA)；Cytofix/CytopermTM固定/透膜試劑盒購自BD Biosciences Pharmigen(Beldford, MA, USA)；皮膚點刺試驗過敏原購自ALK-ABELLO(Denmark)；蒿草花粉提取液、塵螨提取液和梧桐花粉提取液購自北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責任公司；PBS緩沖液購自Solarbio(Solarbio, USA)；其他常用的化學試劑如鹽和緩沖液均為分析純；低溫高速離心機(Thermo Scientific, USA)，水浴鍋(精宏)，F(xiàn)ACSVerse流式細胞儀(BD Biosciences, USA)。

1.2 方法

1.2.1 研究對象 本研究募集門診健康人和急性期入院的AR+AS患者進行皮膚點刺試驗，選取點刺試驗陽性的19例AR+AS患者和點刺試驗陰性的14例健康人為研究對象；哮喘的診斷標準符合2016年中華醫(yī)學會發(fā)布的支氣管哮喘防治指南[12]，鼻炎的診斷標準符合2015年中華醫(yī)學會發(fā)布的變應性鼻炎診療指南[13]。實驗要求患者停止服用治療哮喘和鼻炎的藥物至少2周，且所有志愿者至少1月內(nèi)無呼吸道感染癥狀。本研究獲得錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準，并與每位志愿者簽訂了知情同意書。

1.2.2 收集血液樣本 采集志愿者病史資料(表1)，其中健康人和AR+AS患者的年齡和性別構成比均無統(tǒng)計學差異(表2)；每位志愿者均采集10 mL外周靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中。

表1 志愿者的一般資料

Tab.1 General information of the volunteers

項目健康人AR+AS塵螨(+)蒿草+梧桐(+)塵螨+蒿草+梧桐(+)AR+AS總計例數(shù)1465819年齡(歲)37(24～50)38(34～56)34(20～54)42.5(11～51)38(11～56)性別(女/男)8/63/32/35/310/9病史(年)08(4～16)6(0.2～9)7(3～20)7.5(0.2～20)發(fā)病年齡(歲)NA30(22～48)27(11～50)31.5(0～47)30.5(0～50)

注：表中年齡、病史和發(fā)病年齡的描述均為中位數(shù)(極小值～極大值)，NA：不適用。

1.2.3 流式細胞術檢測外周血嗜酸性粒細群中SP和NK1R的表達 全血加入BFA與蒿草花粉、塵螨和梧桐花粉過敏原粗提液(每種過敏原粗提液的終質(zhì)量濃度均為0.1 μg/mL和1.0 μg/mL)，37 ℃水浴震蕩孵育1 h；1 200 r/min離心后棄去上清，加入死細胞去除染料與FcR阻斷劑，避光孵育15 min；加入BV421耦合的鼠抗人CCR3抗體，避光孵育15 min后裂解紅細胞，離心后用PBS溶液清洗并用固定液固定細胞；透膜洗液清洗后加入FITC耦合的兔抗人SP和APC耦合的鼠抗人NK1R抗體孵育，再次用透膜洗液清洗后上流式細胞儀檢測嗜酸性粒細群中SP和NK1R的表達。

表2 志愿者的年齡和性別構成比

Tab.2 Ratio of volunteers’ age and sex

志愿者資料病例數(shù)健康人AR+ASP性別 男134(30.77%)9(69.23%) 女2010(50.00%)10(50.00%)0.310年齡(歲) <38158(53.33%)7(46.67%) ≥38186(33.33%)12(66.67%)0.304

注：病例數(shù)n<40，性別及年齡采用Fisher確切概率法得出P值。

1.3 統(tǒng)計學分析 用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0分析數(shù)據(jù)，用Mann-WhitneyU分析組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 AR+AS患者嗜酸性粒細胞群中SP表達水平升高 本實驗用流式細胞術檢測了不同過敏原刺激下人體外周血嗜酸性粒細胞群(嗜酸性粒細胞富集群的設門方法見圖1)SP的表達水平。結果顯示，與健康人對照組相比AR+AS患者嗜酸性粒細胞富集群中SP+細胞的比例升高了1.5倍(Z=-2.041，P=0.041)。此外，用質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL蒿草花粉粗提液刺激患者外周血后，SP+細胞的比例上調(diào)約68.1%(Z=-2.637，P=0.008，圖2、圖3)。

圖1 嗜酸性粒細胞群的設門方法

Fig.1 Gating strategies of eosinophil-enriched population

A：細胞碎片去除后的細胞群；B：死細胞去除后的細胞群；C：粒細胞群；D：嗜酸性粒細胞群(CCR3+細胞群)。

圖2 人體外周血嗜酸性粒細胞群中SP+細胞的百分比

Fig.2 Expression of SP+cell in eosinophil-enriched population from human blood

蒿草：蒿草花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；塵螨：塵螨粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；梧桐：梧桐花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘；與相對應的靜息狀態(tài)健康人對照組比較，**P<0.05；與靜息狀態(tài)的過敏性鼻炎合并哮喘患者組比較，*P<0.05。

2.2 AR+AS患者嗜酸性粒細胞群中NK1R表達升高 流式細胞術檢測不同過敏原刺激下人體外周血NK1R+嗜酸性粒細胞的百分比和平均熒光強度。結果顯示，與健康人對照組相比，AR+AS患者嗜酸性粒細胞群中NK1R+細胞的比例和平均熒光強度分別上調(diào)26.4%(Z=-3.207，P=0.001)和85.9%(Z=-4.774，P<0.001)，而加入不同過敏原NK1R+細胞的比例及平均熒光強度均無統(tǒng)計學意義(圖4～圖7)。

圖3 人體外周血嗜酸性粒細胞群中SP表達水平的流式細胞儀代表圖

Fig.3 Representative flow cytometric graphs of expression of SP in eosinophil-enriched population from human blood

Isotype：同型對照；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘；蒿草：蒿草花粉粗提液。

圖4 人體外周血嗜酸性粒細胞群中NK1R+細胞的百分比

Fig.4 Expression of NK1R+cells in eosinophil-enriched population from human blood

蒿草：蒿草花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；塵螨：塵螨粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；梧桐：梧桐花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘；與相對應的靜息狀態(tài)健康人對照組比較，**P<0.05。

圖5 人體外周血嗜酸性粒細胞群中NK1R表達水平的流式細胞儀代表圖
Fig.5 Representative flow cytometric graphs of NK1R expression in eosinophil-enriched population from human blood

Isotype：同型對照；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘。

圖6 人體外周血嗜酸性粒細胞群中NK1R+細胞的平均熒光強度

Fig.6 Mean fluorescent intensity of NK1R+cells in eosinophil-enriched population from human blood

蒿草：蒿草花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；塵螨：塵螨粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；梧桐：梧桐花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘；與相對應的靜息狀態(tài)健康人對照組比較，**P<0.05。

圖7 人體外周血嗜酸性粒細胞群中NK1R+細胞平均熒光強度的流式細胞儀代表圖

Fig.7 Representative flow cytometric graphs of mean fluorescent intensity (MFI) of NK1R+cells in eosinophil-enriched population from human blood

Isotype：同型對照；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘。

3 討 論

支氣管哮喘和過敏性鼻炎均為呼吸道常見的過敏性炎癥疾病，二者常常同時存在(AR+AS)并相互影響，嚴重威脅人類健康，已成為全球性健康問題。SP是一種強效促炎介質(zhì)，其來源廣泛，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，可誘導炎性介質(zhì)如細胞因子、氧自由基、花生四烯酸衍生物和組胺釋放并引起組織損傷，這些炎性介質(zhì)可誘導白細胞募集并進一步放大炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)，過敏性鼻炎和哮喘性咳嗽患者血漿SP表達升高[14-15]；本研究中AR+AS患者嗜酸性粒細胞富集群中SP+細胞的比例升高，提示升高的血漿SP水平來自嗜酸性粒細胞，嗜酸性粒細胞源SP可能在AR+AS的發(fā)生過程起重要作用。

目前，過敏原與SP在AR+AS發(fā)病過程中的關系還未見報道?，F(xiàn)有研究顯示，過敏原鼻激發(fā)試驗可通過上調(diào)肺組織SP的表達從而誘導支氣管高反應性[16]，且過敏性炎癥可促進豚鼠肺神經(jīng)元中SP的合成[17]，提示過敏原可能通過促進SP的表達參與AR+AS的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，蒿草花粉粗提液可誘導AR+AS患者外周血SP+嗜酸性粒細胞的比例上調(diào)約68.1%，提示過敏原可能通過誘導嗜酸性粒細胞釋放SP參與AR+AS；然而，由于目前尚缺少過敏原可通過調(diào)節(jié)嗜酸性粒細胞表達SP參與過敏性疾病的發(fā)病的相關研究，其具體機制尚需進一步研究。

NK1R是SP的高親和力受體，廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中[18]，也表達于氣道平滑肌細胞、黏膜下腺細胞和血管內(nèi)皮細胞[19]。在炎癥的局部微環(huán)境中，SP/NK1R復合物被視為一個整體來發(fā)揮作用，是諸多疾病的分子基礎[20]；此外，NK1R活化可促進T細胞分泌IFN-γ和IL-17，進一步促進和放大炎癥反應[3]。本研究通過流式細胞術發(fā)現(xiàn)AR+AS患者外周血嗜酸性粒細胞NK1R表達增強，而SP可通過與高親和力NK1R和低親和力NK2R、NK3R結合后刺激多種細胞分泌細胞因子，誘導肥大細胞釋放組胺和脫顆粒，并進一步募集淋巴細胞和肥大細胞進而參與過敏性鼻炎發(fā)病[21]，提示SP可能通過嗜酸性粒細胞表面的NK1R參與AR+AS。有報道稱NK1R受體拮抗劑可消除過敏原誘發(fā)的支氣管高反應性[16]，NK1R敲除鼠的鼻黏膜中嗜酸性粒細胞浸潤減少，過敏性鼻炎的癥狀緩解[22]。結合本研究的發(fā)現(xiàn)，我們可以推斷嗜酸性粒細胞源SP可能通過自分泌途徑作用于NK1R誘導炎性介質(zhì)的釋放，進而參與AR+AS發(fā)病，但是否能通過阻斷NKIR的表達進而治療AR+AS，還有待進一步研究。

綜上所述，嗜酸性粒細胞是AR+AS發(fā)病過程中的重要效應細胞，過敏原可能是AR+AS發(fā)病的主要誘因，SP和NK1R是AR+AS發(fā)病的重要介質(zhì)。AR+AS患者血液嗜酸性粒細胞SP和NK1R表達增強，且SP極有可能通過嗜酸性粒細胞表面的NK1R參與AR+AS發(fā)病，SP和NK1R有望成為治療AR+AS的新靶點。

[1] SHAABAN R, ZUREIK M, SOUSSAN D, et al. Rhinitis and onset of asthma: A longitudinal population-based study[J]. Lancet, 2008, 372(9643):1049-1057.

[2] KHAN DA. Allergic rhinitis and asthma: Epidemiology and common pathophysiology[J]. Allergy Asthma Proc, 2014, 35(5):357-361.

[3] WEINSTOCK JV. Substance P and the regulation of inflammation in infections and inflammatory bowel disease[J]. Acta Physiol (Oxf), 2015, 213(2):453-461.

[4] LIU H, YANG X, HOU W. Correlation of c-fos protein expression with neuropeptide content in the lung of bronchial asthmatic rat[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(12):8657-8665.

[5] 章如新，劉國鈞，溫武，等. P物質(zhì)在變應性鼻炎中對RANTES mRNA表達的影響及其意義[J]. 臨床耳鼻咽喉科雜志, 2006, 20(2):73-77.

[6] LIU XM, SHU SY, ZENG CC, et al. The role of substance P in the marginal division of the neostriatum in learning and memory is mediated through the neurokinin 1 receptor in rats[J]. Neurochem Res, 2011, 36(10):1896-1902.

[7] RAMALHO R, ALMEIDA J, BELTRAO M, et al. Substance P antagonist improves both obesity and asthma in a mouse model[J]. Allergy, 2013, 68(1):48-54.

[8] JOHANSSON P, ALMQVIST EG, WALLIN A, et al. Cerebrospinal fluid substance P concentrations are elevated in patients with Alzheimer’s disease[J]. Neurosci Lett, 2015, 609:58-62.

[9] AKIYAMA T, NGUYEN T, CURTIS E, et al. A central role for spinal dorsal horn neurons that express neurokinin-1 receptors in chronic itch[J]. Pain, 2015, 156(7):1240-1246.

[10] MISTROVA E, KRUZLIAK P, CHOTTOVA DVORAKOVA M. Role of substance P in the cardiovascular system[J]. Neuropeptides, 2016, 58:41-51.

[11] ROBINSON P, TAFFET GE, ENGINEER N, et al. Substance P receptor antagonism: A potential novel treatment option for viral-myocarditis[J]. Biomed Res Int, 2015, 2015:645153.

[12] 中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組. 支氣管哮喘防治指南[J]. 中華結核和呼吸雜志, 2016, 39(9).

[13] 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員會鼻科組. 中華醫(yī)學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會鼻科學組. 變應性鼻炎診斷和治療指南[J]. 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2015, 51(1).

[14] ZHANG RX. Substance P in plasma of patients with allergic rhinitis and its clinical significance[J]. Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi, 1993, 28(2):72-73, 123.

[15] OTSUKA K, NIIMI A, MATSUMOTO H, et al. Plasma substance P levels in patients with persistent cough[J]. Respiration, 2011, 82(5):431-438.

[16] HENS G, RAAP U, VANOIRBEEK J, et al. Selective nasal allergen provocation induces substance P-mediated bronchial hyperresponsiveness[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2011, 44(4):517-523.

[17] CHUAYCHOO B, HUNTER DD, MYERS AC, et al. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs[J]. J Allergy Clin Immunol, 2005, 116(2):325-331.

[18] GARCIA-RECIO S, GASCON P. Biological and pharmacological aspects of the NK1-receptor [J]. Biomed Res Int, 2015, 2015:495704.

[19] STEINHOFF MS, VON MENTZER B, GEPPETTI P, et al. Tachykinins and their receptors: Contributions to physiological control and the mechanisms of disease[J]. Physiol Rev, 2014, 94(1):265-301.

[20] ROSSO M, MUNOZ M, BERGER M. The role of neurokinin-1 receptor in the microenvironment of inflammation and cancer[J]. Sci World J, 2012, 2012:381434.

[21] PENNEFATHER JN, LECCI A, CANDENAS ML, et al. Tachykinins and tachykinin receptors: A growing family[J]. Life Sci, 2004, 74(12):1445-1463.

[22] WANG H, ZHANG R, WU J, et al. Knockdown of neurokinin-1 receptor expression by small interfering RNA prevents the development of allergic rhinitis in rats[J]. Inflamm Res, 2013, 62(10):903-910.