楊蕊銘，張慧云,2，鄭文嬌，王君靈，張澤南，何韶衡

(1. 錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應與臨床免疫研究中心，遼寧錦州 121001； 2. 蘇州市相城人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇蘇州 215100； 3. 淄博礦業(yè)集團有限責任公司中心醫(yī)院檢驗科，山東淄博 255120)

特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種常見的慢性炎癥性皮膚疾病，影響10%～20%的人群[1]，任何年齡均可發(fā)病。嗜酸性粒細胞起源于骨髓CD34+造血祖細胞，與嗜堿性粒細胞和肥大細胞一樣，是參與過敏反應的主要效應細胞之一。正常皮膚組織無嗜酸性粒細胞，而AD患者外周血嗜酸性粒細胞增多，皮損處可見嗜酸性粒細胞浸潤，且其數量與疾病的嚴重程度相關。嗜酸性粒細胞在炎性分子和細胞因子的作用下可募集其它炎癥細胞進而加重皮膚損傷[2]。上述研究提示，嗜酸性粒細胞與AD的發(fā)生、發(fā)展有一定的關系。

P物質(substance P, SP)是有特異性的神經活性和促炎活性的神經肽[3]。研究報道，AD鼠模型的皮膚受損部位SP+肥大細胞和神經纖維細胞增多[4]；皮內注射SP可誘導或加重正常人和AD患者皮膚的炎癥反應，提示SP參與AD發(fā)病。NK1R是SP的高親和力受體，SP可通過激活NK1R增強皮膚的炎癥反應[5-6]，濕疹患者外周血單核細胞、Th細胞、NKT細胞和嗜堿性粒細胞NK1R表達顯著升高[7]，AD患者NK1R+單核細胞增多[8]，提示SP可能通過NK1R參與AD發(fā)病。然而，目前尚無AD患者血液嗜酸性粒細胞SP和NK1R的表達的報道。

螨蟲和植物花粉是室內、外過敏原的主要來源，通過與致敏的肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE-FcεRⅠ復合物發(fā)生反應可誘導過敏性疾病的發(fā)生[9]。有報道稱塵螨過敏原可誘導AD的發(fā)生。OVA激發(fā)鼠支氣管后，其肺組織的神經細胞內SP顯著增多[10]，說明過敏原可誘導SP的表達。但是目前尚無過敏原對AD患者血液嗜酸性粒細胞SP和NK1R表達影響的研究。因此，本研究采用流式細胞儀檢測AD患者外周血SP和NK1R在嗜酸性粒細胞富集群中的表達情況，及塵螨、蒿草花粉和梧桐花粉過敏原對SP和NK1R表達的影響，旨在為SP、NK1R與嗜酸性粒細胞的相關研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 蒿草花粉提取液、屋塵螨提取液和梧桐花粉粗提液(北京新華聯協和藥業(yè)限責任公司，中國)，BV421耦合的鼠抗人CCR3、Zombie Aqua Fixable Viability kit(死細胞去除染料)、FcR阻斷劑、紅細胞裂解液、BFA(Biolegend，美國)，FITC標記兔抗人SP抗體(LifeSpan，美國)，APC標記鼠抗人NK1R抗體(R&D Systems，美國)，FITC標記兔IgG同型抗體(eBioscience，美國)，APC標記鼠IgG3同型抗體(R&D Systems，美國)，Cytofix/CytopermTM固定/透膜試劑盒(BD Biosciences，美國)，皮膚點刺試驗過敏原試劑(ALK-ABELLO，丹麥)，其他常用的化學試劑均為分析級純度；低溫高速離心機(Thermo Scientific，美國)，水浴鍋(精宏，中國)，FACSVerse流式細胞儀(BD Biosciences，美國)。

1.2 方法

1.2.1 研究對象納入標準 募集錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科就診的AD患者和門診健康人為志愿者。對志愿者進行皮膚點刺試驗，點刺試驗陽性的AD患者和點刺試驗陰性的健康人為本研究的研究對象。共納入10位健康人和15例AD患者，AD診斷符合2016年發(fā)布的AD診斷指南[11]。本實驗要求所有AD患者至少2周前停止服用抗過敏藥物。本研究獲得了錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準，每位志愿者均簽訂了知情同意書。

1.2.2 收集血液樣本 采集研究對象的資料(表1)；每位研究對象均采集2 mL外周靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中。

表1 志愿者的一般資料

Tab.1 General information of the volunteers

人群例數年齡(歲)女/男病史(年)發(fā)病年齡(歲)健康人1026(25～30)6/4 0 0AD患者1530(2～78)10/54(0.5～17)27(1.5～61) 花粉(+)449.5(36～52)3/15.5(5～10)44(26～47) 蒿草350(36～52)2/15(5～10)45(26～47) 梧桐1 491/0 6 43 螨蟲(+)1 161/0 3 13 螨蟲+花粉(+)1026.5(2～78)6/42.5(0.5～10)24.5(1.5～61) 螨蟲+蒿草621.5(2～78)2/42.5(0.5～17)16.5(1.5～61) 螨蟲+梧桐829.5(2～78)6/23.5(0.5～17)27(1.5～61)

注：表中年齡、病史和發(fā)病年齡的描述均為中位數(極小值～極大值)。

1.2.3 流式細胞術分析血液中嗜酸性粒細胞富集群SP和NK1R的表達 全血加入塵螨、蒿草花粉和梧桐花粉過敏原粗提液(終質量濃度為0.1 μg/mL和1.0 μg/mL)，37 ℃水浴震蕩孵育1 h；1 200 r/min離心后棄去上清，加入死細胞去除染料與FcR阻斷劑，均勻混合后，避光孵育15 min，加入抗CCR3抗體，避光孵育15 min后裂解紅細胞，離心后用固定透膜液固定細胞，加入抗SP和抗NK1R抗體孵育，上流式細胞儀檢測嗜酸性粒細胞富集群中SP和NK1R的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0分析數據。Kruskal-WallisH秩和檢驗分析組間差異，有統(tǒng)計學意義者，用Mann-WhitneyU進一步兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 AD患者外周血嗜酸性粒細胞富集群中SP表達降低 應用流式細胞術檢測AD患者外周血嗜酸性粒細胞富集群(設門方法見圖1)中SP的表達。結果顯示，AD患者的嗜酸性粒細胞富集群中SP+細胞的比例較健康對照組降低了1.17倍(P<0.001，圖2、圖3)，且AD患者嗜酸性粒細胞富集群中SP+細胞的MFI降低了55%(P<0.001，圖4、圖5)，而過敏原對SP的表達無影響(圖3、圖5)。

圖1 嗜酸性粒細胞富集群的設門方法

Fig.1 Gating strategies of eosinophil-enriched cells

A：細胞碎片去除后的細胞群；B：死細胞去除后的細胞群；C：細胞群；D：嗜酸性粒細胞富集群(CCR3+細胞群)。

圖2 AD患者血液嗜酸性粒細胞SP表達變化的流式細胞儀圖

Fig.2 Representative flow cytometric graphs of the expression of SP in eosinophils from human peripheral blood

Isotype：同型對照；HC：健康對照組；AD：特應性皮炎。

圖3 人外周血中嗜酸性粒細胞富集群中SP+細胞的百分比

Fig.3 Percentage of SP+eosinophils in human peripheral blood

蒿草：蒿草花粉粗提液；塵螨：塵螨粗提液；梧桐：梧桐花粉粗提液；與相對應的健康人群比較，#P<0.001。

圖4 人外周血嗜酸性粒細胞群中SP+細胞MFI的流式細胞儀圖

Fig.4 Representative flow cytometric graphs of MFI of SP+eosinophils in human peripheral blood

Isotype：同型對照；HC：健康對照組；AD：特異性皮炎。

2.2 AD患者外周血嗜酸性粒細胞富集群中NK1R表達升高 應用流式細胞術檢測AD患者外周血嗜酸性粒細胞富集群中NK1R的表達情況，結果顯示(圖6、圖7)，與健康對照組相比，AD患者嗜酸性粒細胞富集群中NK1R細胞的比例升高了41%(P=0.001)，而過敏原對NK1R的表達無影響。

3 討 論

嗜酸性粒細胞是血液終末分化的粒細胞之一，可通過釋放趨化因子，誘導炎癥細胞募集而參與包括AD在內的皮膚炎癥反應。研究發(fā)現AD患者外周血中嗜酸性粒細胞數量增多，并與AD的嚴重程度相關，提示嗜酸性粒細胞可能參與AD發(fā)病或募集皮損部位其他炎癥細胞共同參與AD的發(fā)病。

圖5 人外周血中嗜酸性粒細胞富集群中SP+細胞MFI的表達

Fig.5 MFI of NK1R+eosinophils in human peripheral blood

蒿草：蒿草花粉粗提液；塵螨：塵螨粗提液；梧桐：梧桐花粉粗提液；與相對應的健康人群比較，*P<0.001。

圖6 AD患者血液嗜酸性粒細胞NK1R表達變化的流式細胞儀圖

Fig.6 Representative flow cytometric graphs of the expression of NK1R in eosinophils from human blood

Isotype：同型對照；HC：健康對照組；AD：特應性皮炎。

SP具有促炎性質，能夠誘導炎癥介質如細胞因子和組胺的釋放并引起血管擴張，進而誘導過敏反應[12]。SP來源廣泛，體內的多種細胞包括神經細胞和炎性細胞如巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和樹突狀細胞均可分泌SP。研究發(fā)現皮膚病患者如慢性自發(fā)性蕁麻疹患者[13]、濕疹患者[7]、AD患者的血漿SP水平顯著升高[4,8,14]，嗜酸性粒細胞可分泌SP。因此，我們推斷升高的血漿SP水平可能來源于嗜酸性粒細胞，并進一步探究了AD患者血液嗜酸性粒細胞SP的表達。結果發(fā)現，AD患者外周血嗜酸性粒細胞富集群中SP+細胞減少了1.17倍，SP+嗜酸性粒細胞的MFI降低了55%。由于AD患者血液嗜酸性粒細胞數量相對較少，而中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞等均可分泌SP，本研究結果提示可能嗜酸性粒細胞產生的SP不是AD患者血漿SP的主要來源。升高的血漿SP水平可能與AD患者血液CD8+T細胞分泌SP增多有關[8]。

圖7 人外周血中嗜酸性粒細胞富集群中NK1R+細胞的百分比

Fig.7 Percentage of NK1R+eosinophils in human peripheral blood

蒿草：蒿草花粉粗提液；塵螨：塵螨粗提液；梧桐：梧桐花粉粗提液；與相對應的健康人群比較，*P<0.001。

NK1R是神經系統(tǒng)和外周組織SP的高親和力受體[15]，研究發(fā)現SP/NK1R復合物是炎癥微環(huán)境重要的組成部分[16]，NK1R激動劑在過敏原誘導的AD中起重要作用。NK1R敲除鼠和NK1R拮抗劑可抑制神經-炎癥皮膚損傷、NK1R拮抗劑可以緩解慢性瘙癢[17]，提示NK1R參與AD的發(fā)病。本研究首次用流式細胞儀技術發(fā)現AD患者外周血嗜酸性粒細胞富集群中NK1R+細胞的比例升高了41%，提示升高的血漿SP可能通過與嗜酸性粒細胞表面的NK1R結合而發(fā)揮其生物學功能，SP/NK1R復合物在AD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。嗜酸性粒細胞是過敏反應的主要效應細胞之一[12]，AD鼠模型SP+神經纖維附近嗜酸性粒細胞脫顆粒和SP可激活人類嗜酸性粒細胞的報道進一步證實了我們的發(fā)現[18-19]。然而，AD患者嗜酸性粒細胞表面NK1R表達升高的機制尚需進一步研究。

此外，我們還發(fā)現塵螨、梧桐花粉和蒿草花粉過敏原對AD患者嗜酸性粒細胞SP和NK1R表達的影響無統(tǒng)計學差異，可能提示過敏原不是通過誘導嗜酸性粒細胞分泌SP或表達NK1R參與AD。由于塵螨過敏原、艾蒿花粉過敏原和梧桐花粉過敏原對AD患者外周血非嗜酸性粒細胞SP和NK1R的表達影響不同[8]，目前尚無過敏原調節(jié)嗜酸性粒細胞表達SP和NK1R的報道，因此過敏原調節(jié)SP和NK1R表達的機制尚需進一步研究，更詳細的工作可能有助于發(fā)現潛在的機制。

總之，AD患者嗜酸性粒細胞NK1R表達增強，提示嗜酸性粒細胞表達的NK1R可能參與AD發(fā)病，NK1R的拮抗劑或阻斷劑可能是治療AD的有效制劑。

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