何 娟，吳 瓊，李 娜，郝璞珩

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西西安 710049；3. 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710077)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)通常是由于腦內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致血液流入蛛網(wǎng)膜下腔而引起的病變，在人類具有高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。SAH的病理過程包括灌注減少、微血栓形成、大腦水腫以及遲發(fā)性腦缺血，繼而引起不同程度的感覺、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知等方面功能損傷[1-2]。A-β是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)在溶酶體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的異常代謝產(chǎn)物。A-β表達(dá)增加，沉積在新皮質(zhì)、杏仁核及海馬等部位，可以導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能減退[3-4]。近年來A-β對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究頗多，但大多集中于阿爾茲海默病的認(rèn)知功能的研究，對(duì)于SAH后認(rèn)知功能障礙與A-β的關(guān)系研究尚少。

本實(shí)驗(yàn)通過前瞻性研究, 對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬組織A-β蛋白表達(dá)及認(rèn)知功能的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行觀察，探討其與病情及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 江蘇醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的解剖剪、眼科剪、刀柄刀片、顯微有齒鑷及無齒鑷、三角針及小圓針；Olympus BX51 熒光顯微鏡(日本)。

A-β1-40單克隆抗體(美國Bioword Technology公司)；生物素化山羊抗小鼠抗體、封閉用正常羊血清、DAB顯色試劑盒、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠48只，體質(zhì)量250～280 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，統(tǒng)一喂養(yǎng)配制的鼠糧和水，飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，每組又分為3、7、14、28 d 4個(gè)亞組。

1.3 大鼠SAH模型的建立 參照Bederson法[5]，采用刺破頸內(nèi)動(dòng)脈法建立SD大鼠SAH模型。采用3-0單股的直徑0.2 μm、長50 mm尼龍線將頭端鈍化，于距頭端18.5 mm處作標(biāo)記，750 mL/L乙醇清潔后放置在肝素化的生理鹽水中備用。SD大鼠稱重后用100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后取仰臥位固定，取腹側(cè)頸部正中切口，鈍性分離軟組織后暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸動(dòng)脈分叉處，分離頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎并切斷頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈之間的吻合支，然后將頸外動(dòng)脈結(jié)扎并切斷，將其尾端拉直與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線，用直徑為0.2 μm鈍化后的尼龍線從頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段，插入深度約為18.5 mm，使線插進(jìn)大腦中動(dòng)脈開口處，感覺到阻力時(shí)再快速前進(jìn)3 mm刺破血管，制造SAH模型。15 s后迅速將尼龍線拔出，并扎緊頸外動(dòng)脈斷端，縫合皮膚切口。假手術(shù)組大鼠除了不刺破血管壁外，其余操作均與模型組一致。2組大鼠均于麻醉蘇醒后繼續(xù)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，正常喂食和水。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)流程 使用自制的Morris水迷宮裝置，主要由盛水的圓形水池(直徑140 cm，高60 cm)和一個(gè)可移動(dòng)位置的黑色平臺(tái)(直徑10 cm，高35 cm)組成。水池壁上標(biāo)有東、南、西、北4個(gè)注水點(diǎn)，4個(gè)注水點(diǎn)將水池劃分為4個(gè)象限，注水深度為40 cm，使用少量墨汁將水染黑。本實(shí)驗(yàn)選取第1象限中央放置移動(dòng)平臺(tái)。分別于術(shù)后3、7、14、28 d進(jìn)行水迷宮檢測(cè)。每只大鼠分別于4個(gè)象限的同一位置放入水池，分別計(jì)算4個(gè)象限到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間，計(jì)算4個(gè)象限到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間均數(shù)為逃避潛伏期時(shí)間，撤離平臺(tái)后計(jì)算大鼠在原象限滯留的時(shí)間之和為象限滯留時(shí)間。

1.5 取材行A-β免疫組化染色 用100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，繼而開胸，將針頭由左心室插入主動(dòng)脈，使用止血鉗固定，同時(shí)剪開右心耳。生理鹽水200 mL進(jìn)行灌注，再使用40 g/L多聚甲醛200 mL進(jìn)行灌注。然后快速取下全腦組織，將全腦組織用40 g/L多聚甲醛固定24 h后，取視交叉后0.54～6.54 mm區(qū)域制作常規(guī)石蠟包埋切片，行A-β(滴度1∶100)免疫組化染色，貼片封蠟。

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠逃避潛伏期的比較 手術(shù)前所有大鼠神經(jīng)功能均正常，模型組與假手術(shù)組逃避潛伏期時(shí)間無明顯差異(P>0.05)。造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，模型組比假手術(shù)組逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(P<0.05)，象限滯留時(shí)間明顯減少(P<0.05，表1)。

2.2 2組A-β蛋白表達(dá)的比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，A-β標(biāo)記的神經(jīng)元，以細(xì)胞核含有棕黃色的顆?；虬咂臑殛栃?。模型組在造模后3、7、14 d的A-β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)升高，14 d達(dá)到峰值，28 d的A-β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)較前下降。在7、14、28 d時(shí)，模型組與假手術(shù)組的A-β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表2、圖1)。

表1 2組大鼠逃避潛伏期時(shí)間和象限滯留時(shí)間的比較

與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較，*P<0.05。

表2 2組大鼠A-β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)比較

與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較，*P<0.05。

圖1 各組大鼠海馬部位A-β陽性表達(dá)

Fig.1 Positive expression of A-β peptide in the hippocampus of rats (×400)

A：假手術(shù)組；B、C、D、E：分別是模型組3、7、14、28 d時(shí)間點(diǎn)亞組。

3 討 論

SAH的病理過程包括微循環(huán)灌注減少、大腦水腫、血栓形成以及遲發(fā)性腦缺血等，而腦血管痙攣是SAH的主要并發(fā)癥，使得發(fā)病后2周患者的死亡率增加1.5～2倍[6]。血管痙攣造成顱內(nèi)動(dòng)脈血管收縮，導(dǎo)致血流量絕對(duì)減少，繼而引起腦組織灌注不足，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的缺血缺氧性神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，甚至?xí)?dǎo)致缺血性腦組織壞死[7]。本實(shí)驗(yàn)選取SD大鼠，在SAH造模后對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙中的認(rèn)知功能改變及相應(yīng)組織化學(xué)指標(biāo)A-β變化進(jìn)行觀察，探討與病情變化及預(yù)后的關(guān)系。

臨床癡呆的患者，在患病早期一般先出現(xiàn)遺忘型輕型認(rèn)知功能障礙，表現(xiàn)為記憶力損害[8]。運(yùn)用水迷宮來評(píng)定大鼠認(rèn)知功能中的記憶功能是比較恰當(dāng)?shù)?。水迷宮試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，造模前2組大鼠的逃避潛伏期統(tǒng)計(jì)無明顯差異，造模后模型組大鼠尋找平臺(tái)的軌跡表現(xiàn)為隨機(jī)性，表明其學(xué)習(xí)記憶能力有所下降；而假手術(shù)組大鼠在經(jīng)過幾次訓(xùn)練后，大鼠的記憶功能得到強(qiáng)化，逐漸轉(zhuǎn)為直線到達(dá)。模型組大鼠水迷宮潛伏期時(shí)間較假手術(shù)組明顯延長，尋找平臺(tái)錯(cuò)誤的次數(shù)較假手術(shù)組明顯增多，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同一時(shí)間點(diǎn)空間探索的時(shí)間，模型組和假手術(shù)組大鼠分別在4個(gè)象限內(nèi)尋找到平臺(tái)時(shí)間無明顯差異，但模型組比假手術(shù)組尋找平臺(tái)的平均時(shí)間明顯延長。撤離平臺(tái)后大鼠的象限滯留時(shí)間模型組較假手術(shù)組明顯減少。由此可見，模型組的大鼠出現(xiàn)明顯空間學(xué)習(xí)記憶功能下降。

近年來，A-β在神經(jīng)變性疾病中的作用備受關(guān)注，其在阿爾茨海默病中的研究較為深入，而在SAH所導(dǎo)致的生理、病理過程中的作用卻少有研究。A-β是淀粉樣前體蛋白，在正常的老年人腦組織中也存在，但其含量很低，是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞正常代謝的產(chǎn)物。正常生理?xiàng)l件下，A-β的產(chǎn)生、降解和清除是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，當(dāng)發(fā)生基因突變或代謝因素、環(huán)境因素改變等作用，引起A-β表達(dá)增加、細(xì)胞外酶降解水平降低或轉(zhuǎn)運(yùn)至腦外機(jī)制受阻，進(jìn)而在腦組織中沉積增加，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷進(jìn)而引起認(rèn)知功能減退。研究顯示A-β具有神經(jīng)毒性作用，促進(jìn)細(xì)胞膜磷脂超氧化，并抑制磷酸化過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[3-4]。

但認(rèn)知功能障礙與中樞神經(jīng)系統(tǒng)哪些部位受損密切相關(guān)呢？近年研究顯示，海馬接受大腦皮質(zhì)傳遞的信息并進(jìn)行選擇性儲(chǔ)存及記憶，而海馬特別是海馬的中區(qū)是對(duì)缺血性損傷最為敏感的腦區(qū)之一。目前研究認(rèn)為，海馬這種選擇性缺血易損性與學(xué)習(xí)、記憶功能障礙密切相關(guān)，可能是癡呆的病理生理基礎(chǔ)之一。而SAH會(huì)繼發(fā)明顯的血管痙攣，繼而引起神經(jīng)元損傷，是癡呆的重要病理形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，海馬區(qū)錐體細(xì)胞也經(jīng)歷了缺血、水腫等改變，逐漸發(fā)展為基質(zhì)疏松、微空泡形成、損傷脫失。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇海馬作為觀察區(qū)。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，A-β是大腦皮質(zhì)老年斑的核心成分，也是認(rèn)知功能障礙病理改變的特征性成分。在腦內(nèi)產(chǎn)生的A-β主要通過細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞外酶降解和轉(zhuǎn)運(yùn)出腦等途徑得以清除，一般不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響，但其堆積過多時(shí)這種平衡被打破，繼而沉積在杏仁核、海馬及新皮質(zhì)等區(qū)域[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組海馬局部神經(jīng)元出現(xiàn)神經(jīng)元纖維走行紊亂且大片缺失，并出現(xiàn)增粗、腫脹、斷裂等損害表現(xiàn)，且A-β標(biāo)記的神經(jīng)元較假手術(shù)組明顯增多，說明海馬區(qū)的A-β沉積是病理發(fā)生的早期關(guān)鍵事件，引發(fā)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元退行性變的惡性循環(huán)及級(jí)聯(lián)放大的病理生理系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M海馬區(qū)神經(jīng)元A-β表達(dá)明顯增多，結(jié)合其逃避潛伏期延長，我們推測(cè)SAH大鼠繼發(fā)血管痙攣后神經(jīng)細(xì)胞損傷繼而認(rèn)知功能下降可能與以下機(jī)制有關(guān)[9-11]：①神經(jīng)元對(duì)各種傷害性刺激如缺血缺氧、炎性反應(yīng)、自由基損傷、氧化應(yīng)激等的敏感性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡及壞死；②缺血缺氧損傷后，血腦屏障受到破壞，引起A-β基因被激活而過表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞外酶降解和轉(zhuǎn)運(yùn)出腦等清除功能下降，A-β在腦內(nèi)不斷蓄積，經(jīng)一系列的關(guān)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能障礙。

由于A-β具有不同亞型，且實(shí)驗(yàn)的不同濃度等因素對(duì)結(jié)果有一定影響，并且神經(jīng)元相互作用涉及到多條路徑，所以其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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