羅維蕓 王麗娟 何揚(yáng)芳 許世清 蔡寒青

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長春 130041)

糖尿病腎病是常見的糖尿病微血管病變之一，早期表現(xiàn)為尿白蛋白排泄增加，最終可導(dǎo)致患者出現(xiàn)慢性腎功能不全。糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，胰島素降糖治療不能真正阻斷其病變進(jìn)展。C肽是與胰島素等分子量合成與分泌的多肽類物質(zhì)，既往認(rèn)為其無明顯生物學(xué)活性〔1〕。然而，早期臨床觀察顯示，同時(shí)給予C肽和胰島素治療1型糖尿病患者，可降低腎小球高濾過，從而改善腎小球功能及代謝控制，而單獨(dú)應(yīng)用胰島素治療則無此作用〔2〕。在胰島移植治療的1型糖尿病患者中，也觀察到尿蛋白排泄減少和腎功能改善〔3〕，推測與C肽有關(guān)。本文擬分析C肽治療對糖尿病腎病GK大鼠模型氧化應(yīng)激的影響。

1 材料及方法

1.1材料 8周齡SPF級GK大鼠〔上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2007-0005〕及同齡雄性Wistar大鼠〔北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：SCXK(京)2006-0009〕。主要試劑：高脂飼料(中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心)；微量滲透壓泵(Alzet公司，美國)；大鼠C肽(Sigma公司，美國)；大鼠白蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(Assaypro公司，美國)；二喹啉甲酸(BCA)法蛋白測定試劑盒(碧云天公司)；RNeasy總RNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)；SYBR green PCR試劑盒(Toyobo公司，日本)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(Millipore公司，美國)。

1.2方法

1.2.1糖尿病腎病大鼠動物模型的制備 采用高脂飼料喂養(yǎng)GK大鼠并監(jiān)測血糖，當(dāng)連續(xù)3 d血糖≥16.7 mmol/L時(shí)判斷為糖尿病模型建立成功。成模后的糖尿病GK大鼠繼續(xù)給予正常飼料喂養(yǎng)持續(xù)10 w，直至測定尿蛋白≥300 mg/24 h時(shí)，判斷為糖尿病腎病模型。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動物分組 將15只糖尿病腎病GK大鼠隨機(jī)分為3組(n=5)。C肽治療組：在大鼠腹腔手術(shù)植入含2 ml C肽溶液的微量滲透壓泵，設(shè)置50 pmol·kg-1·min-1的恒速緩慢腹腔釋放，每28 d后更換1次；對照組：同樣步驟植入含等量生理鹽水的微量滲透壓泵；胰島素治療組：予甘精胰島素2.5 IU，皮下注射1次/d。正常組(n=5)為同齡正常飼養(yǎng)Wistar大鼠；各組均治療16 w。

1.2.3功能評價(jià)

1.2.3.1血糖、24 h尿蛋白及24 h尿白蛋白定量 治療前及治療后1次/4 w分別測定大鼠尾靜脈空腹血糖；治療前及治療后每4 w將大鼠置于代謝籠收集24 h尿，分別用ELISA法測定24 h尿蛋白(BCA法蛋白測定試劑盒)及24 h尿白蛋白(大鼠白蛋白ELISA檢測試劑盒)。

1.2.3.2腎臟病理改變 治療結(jié)束后處死動物，生理鹽水灌洗后獲取腎臟，其中部分腎組織置于10%中性甲醛固定，石蠟包埋并制備病理切片；部分腎組織以2.5%戊二醛固定，制作透射電鏡標(biāo)本；其余腎組織取腎皮質(zhì)部分物理研磨，收集經(jīng)100目金屬篩網(wǎng)濾過的細(xì)胞懸液，4℃低溫離心，再經(jīng)M199溶液重懸沉淀后過300目金屬篩網(wǎng)，收集獲得腎小球。

1.2.3.3免疫組化 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水、熱修復(fù)后，先以3%H2O2封閉，再分別與一抗羊抗人超氧化物歧化酶(SOD)-1抗體(1∶800)、兔抗小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體(1∶800)，4℃孵育過夜。次日分別加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG或羊抗兔IgG抗體，于37℃條件下孵育反應(yīng)30 min。最后再以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染后封片鏡檢。

1.2.3.4實(shí)時(shí)定量(RT)-PCR 應(yīng)用RNeasy總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別進(jìn)行各組腎小球總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR green PCR試劑盒，應(yīng)用ABI PRISM 7300序列檢測系統(tǒng)經(jīng)兩步法進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，PCR引物序列詳。SOD ：上游：5′-GGTTCACCGCTTGCCTTCT-3′，下游：5′-TTGCACCTTCGTTTCCTG-3′，長度176 bp；iNOS：上游：5′-CACCTTGGAGTTCACCCAGT-3′，下游：5′-ACCACTCGTACTTGGGATGC-3′，長度170 bp；β-actin：上游：5′-GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，下游：5′-ATAGAGCCACCAATCCACACAGAG-3′，長度173 bp。以2-ΔΔCt法半定量分析各組腎小球組織SOD基因及iNOS基因在mRNA水平表達(dá)的差異。

1.2.3.5Wester印跡 提取各組糖尿病腎病大鼠腎小球總蛋白，分別取各組30 μg總蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后封閉、洗膜，分別加入羊抗人SOD-1抗體(1∶200)、兔抗小鼠iNOS抗體(1∶800)及小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(0.5 μg/ml)，4℃下雜交反應(yīng)過夜。次日洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶15 000)、羊抗兔lgG(1∶15 000)或羊抗小鼠IgG(0.25 μg/ml)分別進(jìn)行二抗雜交。最后使用ECL試劑顯色，暗室曝光成像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖、24 h尿蛋白定量及24 h尿白蛋白定量比較 治療后胰島素治療組血糖顯著下降(P<0.05)，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，C肽治療組血糖無顯著下降，與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C肽治療組24 h尿蛋白及24 h尿白蛋白均顯著減少(P<0.01)，胰島素治療組無明顯降低，C肽治療組明顯優(yōu)于胰島素治療組(P<0.01)。見圖1。

2.2各組腎小球PAS染色及投射電子顯微鏡下腎小球形態(tài)學(xué)改變 光鏡下腎臟PAS染色顯示：正常組大鼠腎小球毛細(xì)血管袢薄而清晰；對照組腎小球系膜細(xì)胞增生，基底膜明顯增厚，毛細(xì)血管袢有大量不規(guī)則、結(jié)節(jié)狀PAS陽性物質(zhì)沉積，腎小球球囊間隙明顯變窄，部分幾乎消失；C肽治療組腎小球毛細(xì)血管袢則較規(guī)則、清晰，PAS陽性物質(zhì)沉積較少，腎小球囊間隙存在；胰島素治療組的腎小球硬化與對照組相近。電鏡下，與正常大鼠腎臟相比，對照組大鼠基底膜明顯增厚，系膜區(qū)基質(zhì)增多，足細(xì)胞排列不規(guī)則，部分足突缺失或融合；C肽治療組基底膜增厚改變較輕，足細(xì)胞的形態(tài)和排列紊亂也較輕，均明顯優(yōu)于胰島素治療組。見圖2。

圖1 各組血糖、24 h尿蛋白及24 h尿白蛋白比較

圖2 各治療組腎小球基底膜的病理改變

圖3 各組腎小球SOD與iNOS表達(dá)的差異(×400)

2.3免疫組化染色結(jié)果 如圖3針對SOD的免疫組化染色顯示，正常組大鼠腎臟染色濃集，腎小球系膜細(xì)胞可見棕黃色陽性染色；對照組大鼠腎小球陽性染色明顯減少，而C肽治療組腎小球系膜細(xì)胞的陽性染色較胰島素治療組及對照組明顯增多。針對iNOS的免疫組化染色顯示，相對于正常組大鼠腎小球，對照組腎小球與活性氧(ROS)產(chǎn)生過多相關(guān)的iNOS表達(dá)上調(diào)，C肽治療顯著下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎小球iNOS的表達(dá)；胰島素治療也可以部分降低iNOS在腎小球的表達(dá)。

2.4RT-PCR和Wester印跡方法檢測腎小球SOD及iNOS mRNA、蛋白表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，正常組設(shè)為1，對照組腎小球iNOS mRNA表達(dá)上調(diào)5.09倍，SOD表達(dá)降低65%(P<0.05)；C肽治療組顯著下調(diào)iNOS mRNA表達(dá)至正常大鼠的1.57倍，升高SOD

mRNA表達(dá)至正常大鼠的82%(P<0.05)；胰島素治療組也可以部分降低iNOS mRNA在腎小球的表達(dá)至正常大鼠的3.5倍(P<0.05)，但對SOD mRNA在腎小球的表達(dá)(0.76)無明顯影響(P>0.05)。Western 印跡檢測各組蛋白水平見圖4。

1～4：正常組，對照組，C肽治療組，胰島素治療組圖4 各組SOD及iNOS在mRNA與蛋白水平的表達(dá)差異

3 討 論

近年來研究顯示，C肽可能具有防治糖尿病微血管病變的作用和應(yīng)用價(jià)值〔3〕，其中在防治糖尿病腎病方面，有動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C肽治療1型糖尿病大鼠可降低腎小球高濾過和尿蛋白漏出〔4〕。C肽治療還能抑制糖尿病大鼠的Ⅳ型膠原合成，從而減緩細(xì)胞外基質(zhì)增生并抑制腎小球增生〔5〕。在體外培養(yǎng)的腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，C肽可阻斷高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生〔6〕。本研究提示C肽治療降低尿蛋白排泄的作用獨(dú)立于降糖作用之外。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病腎病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，也是糖尿病腎損傷的誘發(fā)因素。氧化應(yīng)激是由ROS和高血糖的氮元素產(chǎn)生，可以引起基因表達(dá)的異常、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變及誘導(dǎo)糖尿病腎病發(fā)展途徑的激活〔7〕。研究顯示多種分子途徑參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展〔8〕。這些途徑包括蛋白激(PK)C、多元醇和己糖胺通路的激活及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β的增加，其他途徑還包括MAPK通路的活化，晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的增加，內(nèi)皮素受體的激活及信號通路和表觀遺傳學(xué)機(jī)制。此外，大量的研究數(shù)據(jù)表明抗氧化劑對于糖尿病并發(fā)癥(包括糖尿病腎病)的進(jìn)展有潛在的預(yù)防作用，如維生素E、α-硫辛酸、N-乙酰半胱氨酸等〔9～12〕。本研究結(jié)果提示C肽治療可能通過抑制氧化應(yīng)激而減緩糖尿病腎病病變進(jìn)展，改善腎小球基底膜增厚等結(jié)構(gòu)異常，并減少尿蛋白排泄，達(dá)到防治糖尿病腎病的作用。

1Johansson BL,Kernell A,Sjoberg S,etal.Influence of combined C-peptide and insulin administration on renal function and metabolic control in diabetes type 1〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,1993;77(4):976-81.

2Boggi U,Vistoli F,Amorese G,etal.Results of pancreas transplantation alone with special attention to native kidney function and proteinuria in type 1 diabetes patients〔J〕.Rev Diabet Stud,2011;8(2):259-67.

3Cantarovich D,Perrone V.Pancreas transplant as treatment to arrest renal function decline in patients with type 1 diabetes and proteinuria〔J〕.Semin Nephrol,2012;32(5):432-6.

4Nakamoto H,Kajiya F.In vivo quantitative visualization analysis of the effect of C-peptide on glomerular hyperfiltration in diabetic rats by using multiphoton microscopy〔J〕.Microcirculation,2013;20(5):425-33.

5Sun W,Gao X,Zhao X,etal.Beneficial effects of C-peptide on renal morphology in diabetic rats〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin,2010;42(12):893-9.

6Vejandla H,Hollander JM,Kothur A,etal.C-peptide reduces mitochondrial superoxide generation by restoring complex I activity in high glucose-exposed renal microvascular endothelial cells〔J〕.ISRN Endocrinol,2012;2012:162802.

7Arora MK,Singh UK.Oxidative stress:meeting multiple targets in pathogenesis of diabetic nephropathy〔J〕.Curr Drug Targets,2014;15(5):531-8.

8Usuelli V,La Rocca E.Novel therapeutic approaches for diabetic nephropathy and retinopathy〔J〕.Pharmacol Res,2015;98:39-44.

9Evans JL,Goldfine ID,Maddux BA,etal.Oxidative stress and stress-activated signaling pathways:a unifying hypothesis of type 2 diabetes〔J〕.Endocr Rev,2002;23(5):599-622.

10King GL,Loeken MR.Hyperglycemia-induced oxidative stress in diabetic complications〔J〕.Histochem Cell Biol,2004;122(4):333-8.

11Pennathur S,Heinecke JW.Mechanisms for oxidative stress in diabetic cardiovascular disease〔J〕.Antioxid Redox Signal,2007;9(7):955-69.

12Giacco F,Brownlee M.Oxidative stress and diabetic complications〔J〕.Circ Res,2010;107(9):1058-70.