王 睿 金明順 徐天嬌 何 寧 朱 玉 王 偉

(齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

抑郁癥逐漸成為繼心、腦血管疾病后第二位全球性精神系統(tǒng)疾病。抑郁癥發(fā)病具有明顯性別差異，女性抑郁癥發(fā)病率約是男性2倍〔1〕。女性情感行為受激素水平影響，在激素變化的特殊時間點，如經(jīng)前期、妊娠期、產(chǎn)褥期及圍絕經(jīng)期易發(fā)抑郁〔2〕。圍絕經(jīng)期是女性生殖系統(tǒng)由旺盛走向衰老的重要時期，是女性抑郁癥高發(fā)時期，約有46%女性在圍絕經(jīng)期患有抑郁癥〔3〕。雌激素(E)水平低下及外界環(huán)境刺激被認為是圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)病內(nèi)、外兩個因素。本研究觀察外源性補充E對OVX后抑郁癥動物模型小鼠行為學影響并探討其神經(jīng)生化機制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健公司廣州分公司，批號258A2)，小鼠5-羥色胺(HT)試劑盒(北京誠林生物技術(shù)有限公司分裝，批號20131201)、小鼠去甲腎上腺素(NE)試劑盒、多巴胺(DA)試劑盒(北京誠林生物技術(shù)有限公司分裝，批號20131215)，其他試劑均為國產(chǎn)分析醇試劑。

1.2主要儀器 曠場反應(yīng)箱(自制)，強迫游泳水缸(自制)，DT1001電子天平(常熟市意歐儀器儀表有限公司)，5026型酶聯(lián)免疫檢測儀(奧地利TECAN公司)，MR1812型臺式高速低溫離心機(法國JOUAN公司)，PUEELAB PLUS超純水系統(tǒng)(美國波爾公司)，全自動酶標儀(成都貝斯達儀器有限公司)等。

1.3動物 清潔級雌性昆明小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號〔SCXK(黑)2013-0004〕。

1.4動物分組、模型制備及給藥 曠場實驗(OFT)篩選評分相近、體重均勻小鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。飼養(yǎng)條件為，5只/籠，室溫(22±1)℃，濕度(50±10)%，自然光照(12 L/12 D)，自由攝食飲水。隨機分為5組，即假手術(shù)組(Sham)、OVX組、CUMS組、OVX+CUMS組及E治療組(OVX+CUMS +E)，每組10只。采用OVX法制備E低下動物模型，其中Sham組、CUMS組僅剪去卵巢旁一小團脂肪組織，大小同OVX組。小鼠OVX后，常規(guī)飼養(yǎng)1 w。1 w后，采用CUMS法制備抑郁癥小鼠模型，方法為禁食、禁水(24 h)、晝夜顛倒(12 D/12 L)、冰水游泳(5 min)、45℃環(huán)境熱烘(5 min)、夾尾(1 min)、潮濕墊料、電擊足底等7種刺激，這7種刺激每天隨機采取一種，每天刺激都不規(guī)律，共計21 d。E治療組(0.15 mg/kg)于每日應(yīng)激前1 h灌胃給藥，其余各組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日每次0.2 ml。

1.5陰道上皮角化實驗 小鼠OVX后，7 d內(nèi)連續(xù)監(jiān)測各實驗組陰道上皮脫落細胞相，以證明動物去勢是否成功。

1.6動物一般體征 每天于應(yīng)激前觀察各組一般體征，觀察并記錄其自由活動及探索行為。

1.7體質(zhì)量測試(BWM) 在實驗第1、21天分別進行小鼠體質(zhì)量測定。

1.8OFT 制備小鼠曠場反應(yīng)箱(40 cm×40 cm×38 cm)，內(nèi)壁涂黑，底面平均劃分25個小格。選取安靜場地，將小鼠放入反應(yīng)箱中央，攝像系統(tǒng)記錄動物在曠場內(nèi)6 min的行為學表現(xiàn)，計算水平運動(3或4只腳同在一個格內(nèi)計1分，穿越1格計1分，沿線行走每8 cm計1分)及垂直運動得分(記錄小鼠站立次數(shù)；雙前足離地1次為1分)。兩只動物之間用75%酒精擦拭底部及四壁，以免“前任者效應(yīng)”。實驗在應(yīng)激第1、21天各測定1次。

1.9強迫游泳實驗(FST) 將小鼠單獨置于水深15 cm的玻璃缸內(nèi)(高20 cm，直徑 14 cm)，水溫(25±1)℃，游泳6 min，觀察記錄后4 min內(nèi)小鼠在水中累計不動時間。每只小鼠實驗結(jié)束后沖洗水缸、換水，避免對下一只測試小鼠產(chǎn)生影響。實驗在應(yīng)激第1、21天各測定1次。

1.10腦組織單胺類遞質(zhì)5-HT、NE、DA含量測定 小鼠造模結(jié)束后第2天，斷頭取腦，冰臺上迅速取小鼠腦組織，稱取腦組織重量。勻漿，4℃ 3 000 r/min離心20 min，靜止，吸取上清，-80℃保存。按照試劑盒說明書測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE及DA含量。

1.11統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行one-way ANOVA，LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1陰道上皮角化實驗 與Sham組及CUMS組比較，OVX組陰道脫落細胞呈現(xiàn)大量白細胞和少量上皮細胞，7 d內(nèi)連續(xù)監(jiān)測，無周期性陰道細胞變化，角化細胞百分率(0.10±0.05)%，證明小鼠去勢成功。見圖1。

圖1 各組陰道脫落細胞相(HE，×400)

2.2動物一般體征 應(yīng)激第1天，各組皮膚光澤，常梳理毛發(fā)，對周圍環(huán)境嗅查尋覓，自主活動及探索活動正常。應(yīng)激第21天，與Sham組比較，OVX組、CUMS組自主活動及探索活動減少，理毛次數(shù)減少；與CUMS組比較，OVX+CUMS組毛色灰暗、粗糙、常倦怠不動；給予E治療后，可改善小鼠一般體征，表現(xiàn)為皮膚光澤度較好，梳理毛發(fā)，有自主活動及探索活動。

2.3BWM 造模第1天，各組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模第21天，與Sham組比較，CUMS組體質(zhì)量下降、OVX組體質(zhì)量明顯增加(雌激素低下使動物體質(zhì)量增加)(P<0.01)；與CUMS組比較，OVX+CUMS組體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)；與OVX+CUMS組比較，E治療組體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.4OFT 造模第1天，各組OFT水平及垂直運動得分無顯著差異(P>0.05)。造模第21天，與Sham組比較，CUMS組、OVX組OFT水平及垂直運動得分明顯減少(P<0.01)；與CUMS組比較，OVX+CUMS組OFT水平及垂直運動得分明顯下降(P<0.01)；與OVX+CUMS組比較，E治療組OFT水平及垂直運動得分顯著增加(P<0.01或P<0.05)。見表1。

2.5FST 造模第1天，各組FST不動時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模第21天，與Sham組比較，CUMS組、OVX組FST不動時間顯著增加(P<0.01)；與CUMS組比較，OVX+CUMS組FST不動時間顯著增加(P<0.01)；與OVX+CUMS組比較，E治療組FST不動時間顯著減少(P<0.01)。見表1。

2.6腦組織單胺類遞質(zhì)5-HT、NE、DA含量測定 與Sham組比較，CUMS組、OVX組腦組織5-HT、NE及DA含量明顯減少(P<0.01)。與CUMS組比較，OVX+CUMS組腦組織5-HT、NE及DA含量明顯減少(P<0.01)。與OVX+CUMS組比較，E治療組腦組織5-HT、NE及DA含量明顯增加(P<0.01)。見表2。

表1 各組體質(zhì)量、OFT水平及垂直運動得分、FST不動時間比較

與Sham組比較：1)P<0.01；與CUMS組比較：2)P<0.01；與OVX+ CUMS組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；下表同

表2 各組腦組織5-HT、DA含量

3 討 論

女性體內(nèi)E含量變化與抑郁癥發(fā)病程度相關(guān)〔1〕，性激素、與性別有關(guān)的基因在抑郁癥的發(fā)病機制中具有重要作用〔2〕。因此，應(yīng)激、激素、中樞神經(jīng)遞質(zhì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互作用與關(guān)系，在女性情感性精神疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

單胺類遞質(zhì)主要包括兒茶酚胺類(NE、DA及腎上腺素)及吲哚類(HT)兩類。兩類神經(jīng)元分別以酪氨酸、色氨酸為底物，經(jīng)過系列酶與底物羥化脫羧反應(yīng)后形成，并儲存于突觸前膜囊泡內(nèi)，依靠其轉(zhuǎn)運體重攝取或被酶清除以維持體內(nèi)動態(tài)平衡〔4〕。在闡明有關(guān)抑郁癥發(fā)病機制及臨床抗抑郁藥物治療中，“單胺類遞質(zhì)缺乏”學說認為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT、NE及DA含量不足是引發(fā)抑郁癥的主要原因。

E是一組甾體類激素，為“天然神經(jīng)保護因子”，是具有神經(jīng)調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護作用的激素〔3〕。主要源于脊椎動物卵巢和腎上腺皮質(zhì)，給藥后生物利用度97%～99%，半衰期13 h，經(jīng)肝臟代謝，經(jīng)尿排泄。E主要包括雌二醇(E2)、雌三醇(E3)及雌酮(E1)，以E2含量最多，生理效應(yīng)最強。卵巢內(nèi)膜細胞與顆粒細胞是E主要合成器官。腦是E作用的重要靶器官，E與其受體結(jié)合，通過基因組與非基因組機制對生殖、認知及情緒調(diào)節(jié)有關(guān)區(qū)域如皮質(zhì)、海馬有一定作用。E可作用中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)情緒反應(yīng)及認知功能。E對大腦神經(jīng)細胞具有多靶向調(diào)節(jié)作用，可影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成、神經(jīng)元生長、突觸形成、神經(jīng)元棘突密度和神經(jīng)傳導作用〔5〕，可調(diào)控星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞生長〔6〕，可促進神經(jīng)纖維形成并抑制神經(jīng)細胞凋亡〔7〕。動物實驗和臨床實驗均證明，女性抑郁與E撤退關(guān)系密切。E抗抑郁的潛在機制與調(diào)控單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量及其受體表達〔8〕，通過非基因組機制調(diào)控腦源性生長因子(BDNF)、cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)等信號蛋白表達，促進海馬神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)〔9,10〕。

本研究結(jié)果表明，給予E治療后，可改善抑郁模型小鼠行為學異常及增加腦組織單胺類遞質(zhì)5-HT、DA含量變化而具有抗抑郁作用，但具體抗抑郁有關(guān)信號通路機制仍需進一步探討。

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