肖 斌 張春燕 羅國松 趙曉芳 余文靜 成 鷹 段春燕 王進舉 馮春紅 夏先明 代榮陽

(西南醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，四川 瀘州 646000)

細胞接觸抑制是正常細胞生長的關鍵特性〔1，2〕。然而，癌細胞通常喪失接觸抑制，使之能夠無限制增殖〔3〕。原癌基因c-Myc在多種組織細胞中廣泛表達，對細胞生長和增殖起重要調節(jié)作用〔4〕。據統(tǒng)計，c-Myc在幾乎近一半的人類腫瘤中表達失調〔5～7〕。膽管癌(CCA)惡性程度極高，預后較差〔8〕。研究顯示c-Myc在CCA中具有重要調控作用，在膽汁淤積性肝損傷和CCA形成過程中可誘導c-Myc表達，并且c-Myc基因敲除后能抑制CCA的進展〔9〕。已有研究指出雷帕霉素靶蛋白(mTOR)參與調節(jié)細胞接觸抑制，且mTOR信號通路在CCA細胞的生長和存活中發(fā)揮重要作用〔10〕。YAP參與調控細胞接觸抑制、腫瘤發(fā)生等過程，Merlin是YAP上游的關鍵抑制分子〔11〕。本實驗旨在探討c-Myc在CCA細胞抵抗接觸抑制中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1材料 c-Myc抑制劑10058-F4(F4)和YAP抑制劑verteporfin(VP)購自Selleck Chemicals公司；mTOR抑制劑rapamycin購自Tocris Bioscience公司；抗細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p27、c-Myc、p-p70S6K、p70S6K、p-S6、p-YAP(ser127)、YAP、p-Merlin和Merlin一抗均購自Cell Signaling Technology公司；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗、人c-Myc siRNA和對照siRNA購自Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及處理 人正常膽管上皮細胞HIBEC、CCA細胞QBC939和RBE用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2，37℃孵箱內培養(yǎng)。細胞以不同的密度鋪板，細胞實現低密度(約50%匯合度)和高密度(100%匯合度)。

1.2.2Western印跡分析 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質后，采用半干式電轉移將蛋白分子轉移到硝酸纖維素(NC)膜，電轉移結束后NC膜用Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次(5 min/次)，封阻緩沖液(5% BSA)在室溫下密閉輕搖動封阻1 h。TBST洗滌3次(5 min/次)后，NC膜與一抗稀釋液室溫下輕搖動孵育2 h，TBST洗滌3次(5 min/次)。NC膜與熒光二抗稀釋液于室溫下輕搖動孵育1 h，TBST洗滌3次(5 min/次)。Odyssey掃描顯色。

1.2.3流式細胞術 將細胞固定過夜，重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并在暗盒中用碘化丙啶(PI)染色30 min。在Becton-Dickinson FAC Scan流式細胞儀系統(tǒng)上測量DNA含量。

1.2.4RNA干擾 細胞接種于35 mm皿，將10 μl濃度為20 μmol/L的siRNA儲存液與100 μl DMEM混合，同時將8 μl Lipofectamine 2000與100 μl DMEM混合，然后將兩種溶液混勻并加入正常培養(yǎng)的細胞中。培養(yǎng)6 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1低、高密度培養(yǎng)時HIBEC、QBC939和RBE細胞周期分布情況 如圖1流式細胞術結果顯示，高密度培養(yǎng)的HIBEC細胞出現接觸抑制，其細胞周期停滯在G0/G1期，而QBC939和RBE細胞在高密度時仍有較強的增殖能力(圖1A)。Western印跡結果顯示，高密度培養(yǎng)的HIBEC細胞中CyclinD1蛋白水平比低密度時顯著下調，而p27蛋白表達上調。高密度培養(yǎng)的QBC939和RBE細胞中CyclinD1持續(xù)高表達且未見p27表達明顯誘導(圖1B)。

圖1 CCA細胞抵抗接觸抑制

2.2Western印跡檢測HIBEC、QBC939和RBE細胞在低、高密度時c-Myc的蛋白水平 與低密度相比，高密度培養(yǎng)的HIBEC細胞中c-Myc蛋白明顯下降(P<0.05)，而QBC939和RBE細胞在低、高密度培養(yǎng)時c-Myc蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Western印跡結果表明，10058-F4處理顯著下調QBC939和RBE細胞中c-Myc的蛋白表達，同時抑制CyclinD1表達。流式細胞術結果證實10058-F4可誘導高密度的QBC939和RBE細胞周期停滯在G0/G1期。見圖2，圖3。

2.3c-Myc通過mTOR信號通路促進人QBC939抵抗接觸抑制 在HIBEC細胞中，p70S6K和S6的磷酸化水平在高密度時受到顯著抑制，而在QBC939和RBE細胞中無顯著變化(圖4A)。采用c-Myc抑制劑10058-F4處理高密度QBC939和RBE細胞后，p70S6K和S6的磷酸化水平明顯減弱(圖4B)。siRNA干擾c-Myc表達結果顯示干擾c-Myc不僅能夠下調磷酸化p70S6K和S6，還顯著抑制了CyclinD1的表達(圖4C)。rapamycin處理的高密度QBC939和RBE細胞周期停滯在G0/G1期。見圖5。

圖2 c-Myc在高密度膽管癌細胞中的表達及其對CyclinD1表達的影響

圖3 c-Myc調控CCA細胞抵抗接觸抑制

圖4 c-Myc通過mTOR信號通路促進CCA細胞抵抗接觸抑制

圖5 抑制mTOR恢復CCA細胞接觸抑制

2.4YAP調控c-Myc在高密度CCA細胞中的異常高表達 在高密度HIBEC細胞中，YAP磷酸化水平顯著上調，而在高密度QBC939和RBE細胞中無顯著改變(圖6A)。Western印跡分析提示，在高密度QBC939和RBE細胞用verteporfin抑制YAP活性不僅下調了c-Myc蛋白水平，還抑制了CyclinD1表達(圖6B)。

免疫印跡結果提示，在HIBEC細胞中，Merlin磷酸化在高密度時受到抑制，表明Merlin活性上調，而在高密度QBC939和RBE細胞中Merlin磷酸化水平反而上調，說明Merlin活性受到抑制(圖6C)。

圖6 Merlin/YAP調控c-Myc介導的CCA細胞抵抗接觸抑制

3 討 論

接觸抑制是指正常細胞在生長培養(yǎng)過程中，當細胞相互接觸匯合時，細胞的增殖能力受到抑制，出現生長停滯。接觸抑制的丟失是大多數腫瘤細胞的一大標志〔3〕，失去接觸抑制調控的腫瘤細胞獲得了無限增殖的潛能。本實驗結果顯示，正常膽管上皮細胞在高密度時出現接觸抑制現象，而CCA細胞抵抗接觸抑制。有許多信號分子參與調控細胞接觸抑制的發(fā)生〔11〕，但腫瘤細胞抵抗接觸抑制的具體機制仍有待闡明。

研究證實，c-Myc調控CCA的發(fā)生發(fā)展〔12〕，而c-Myc在膽管癌進展中的具體分子機制仍不清楚。本研究顯示c-Myc在增殖狀態(tài)下的正常膽管上皮細胞中高表達，而在細胞發(fā)生接觸抑制時受到顯著抑制。c-Myc在高低密度不同培養(yǎng)狀態(tài)下的人CCA細胞中始終保持高水平表達，因而推測c-Myc可能參與調控CCA細胞接觸抑制的丟失。此假設在后續(xù)實驗得到了證實，抑制c-Myc活性或干擾c-Myc表達均可恢復CCA細胞的接觸抑制。這表明c-Myc能夠通過促進CCA細胞逃避細胞接觸抑制促進CCA的進程。

mTOR是哺乳動物組織和細胞中廣泛存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與正常細胞代謝、細胞運動、細胞存活和血管生成等過程〔13〕。mTOR信號通路在腫瘤細胞中通常呈過度激活狀態(tài)，與腫瘤細胞的增生、分化、凋亡、轉移和侵襲有關，在許多惡性腫瘤中起重要作用〔14〕。研究表明，mTOR信號失活是細胞接觸抑制的重要分子事件〔10〕。本實驗發(fā)現在發(fā)生接觸抑制的正常膽管上皮細胞中mTOR活性受到顯著抑制。研究表明，mTOR信號通路參與CCA的發(fā)生發(fā)展，并且抑制mTOR后能抑制CCA細胞增殖〔10〕，但mTOR是否參與調控CCA細胞接觸抑制未見報道。本研究結果發(fā)現mTOR在CCA細胞低、高密度中均保持高度活化狀態(tài)，而rapamycin抑制mTOR后使得CCA細胞恢復接觸抑制，并且10058-F4抑制c-Myc后顯著降低了高密度CCA細胞中mTOR的活性。這些結果表明c-Myc可通過mTOR促進膽管癌細胞接觸抑制。

本實驗發(fā)現，在發(fā)生接觸抑制的正常膽管上皮細胞中YAP活性受到抑制，而在高密度培養(yǎng)的膽管癌細胞中YAP仍保持高活性水平。抑制YAP活性顯著降低高密度培養(yǎng)的膽管癌細胞中c-Myc和CyclinD1表達，表明c-Myc在高密度膽管癌細胞中的表達失調受YAP信號調控。此外，本研究結果提示，YAP/c-Myc在高密度膽管癌細胞中的失調與腫瘤抑制蛋白Merlin功能失調緊密相關。Merlin/YAP/c-Myc/mTOR信號在CCA細胞逃避接觸抑制中的重要作用，對該通路在CCA抵抗接觸抑制中的進一步研究不僅有助于膽管癌分子機制的闡明，也可能為CCA的防治提供新思路。

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