陳文明 龍仙萍 趙然尊 石 蓓

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

Toll樣受體(TLR)主要在單核巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)表面有多種TLR表達(dá)，且TLR4配體可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控MSCs的增殖和分化〔1，2〕。TLR4通過Wnt/β-Catenin信號(hào)促進(jìn)乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移〔3〕。本研究通過內(nèi)毒素脂多糖(LPS)作用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，觀察TLR4能否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs增殖。

1 材料與方法

1.1一般材料 6周齡SD大鼠，體重50～100 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：LPS(購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；TLR4阻斷劑(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、β-actin、β-catenin、細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1和c-myc抗體及山羊抗兔二抗(均購(gòu)自博奧森科技有限公司)；TRIzol和PCR試劑盒(均購(gòu)自日本TaKaRa公司)；倒置熒光顯微鏡(購(gòu)自日本OLYMPUS公司)；凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀(均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司)。分為對(duì)照組 〔磷酸鹽緩沖液(PBS)〕、LPS組(1.0 μg/ml)、TLR4阻斷劑+LPS組(TLR4阻斷劑0.5 μg/ml與細(xì)胞共同作用4 h后加入LPS 1.0 μg/ml)、Wnt信號(hào)通路抑制因子(DKK-1)+LPS組(加入DKK-1 0.1 mg/ml后，即刻加入LPS 1.0 μg/ml)各3只。

1.2方法

1.2.1BMSCs的培養(yǎng)和鑒定 大鼠用手術(shù)剪刀快速斷頸處死，用酒精浸泡消毒，在超凈工作臺(tái)分離股骨和脛骨，沖出骨髓，經(jīng)離心后棄上清，之后制成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃，5% CO2無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，利用流式儀檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)〔4〕。

1.2.2CCK-8 檢測(cè) BMSCs 的增殖 根據(jù)CCK-8試劑盒檢測(cè)BMSCs 的增殖能力。

1.2.3Western印跡檢測(cè)BMSCs中TLR4蛋白表達(dá) 對(duì)照組和LPS組細(xì)胞培養(yǎng)至3 d后收集細(xì)胞，將細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞總蛋白，然后用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法檢測(cè)總蛋白濃度。配膠上樣，恒壓電泳后轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，聚偏氟乙烯(PVDF)膜封閉2 h，與一抗結(jié)合(TLR4 1∶200)、4℃過夜，二抗孵育2 h，用凝膠成像系統(tǒng)曝光掃描，采用Quantity One定量分析軟件系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行灰度測(cè)定，以目的條帶和β-actin比值作為半定量依據(jù)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量(RT)-PCR檢測(cè)BMSCs中β-catenin、c-myc及cyclinD1 mRNA表達(dá) 細(xì)胞放置于37℃，5% CO2無菌細(xì)胞養(yǎng)培箱中培養(yǎng)3 d，用Trizol法提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄，然后根據(jù)試劑盒說明書，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。基因引物序列為β-catenin上游：5′-TGGTGACAGGGAAGACATCA-3′,下游：5′-CCATAGTGAAGGCGAACTGC-3′,108 bp;c-Myc上游：5′-GAGACAGATCAGCAACAACCGA-3′,下游：5′-CTGCTTGGACGGACAGGATG-3′,227 bp;Cyclind1上游：5′-TTCGTTGCCCTCTGTGCCA-3′,下游：5′-GAAGCGTGTGAGGCGGTAGTAG-3′,196 bp;β-actin上游：5′-CCACGAACTACCTTCAACTCC-3′,下游：5′-GTGATCT CCTTCTGCATCCTGT-3′,132 bp。

1.2.5Western印跡檢測(cè)BMSCs中β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白表達(dá) 一抗?jié)舛确謩e為β-catenin 1∶200、c-myc 1∶300、cyclinD1 1∶200。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的培養(yǎng)與鑒定 在顯微鏡下見原代BMSCs呈圓形亮點(diǎn)狀分布于培養(yǎng)瓶底部，P1代BMSCs呈多角形、短棒或短梭形；P2代BMSCs形態(tài)呈長(zhǎng)梭狀均勻分布；P3代BMSCs細(xì)胞體積較大，與P2代BMSCs細(xì)胞形態(tài)相似。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，BMSCs表面標(biāo)志物CD29為98.6%，CD90為99.7%，CD45為2.7%。見圖1。

2.2BMSCs的增殖情況 如圖2所示，LPS剌激后，細(xì)胞的增殖能力得到了增強(qiáng)，第3天增殖最為明顯，且LPS組(1.370±0.143)顯著高于對(duì)照組(1.210±0.101，P<0.01)。

2.3BMSCs中β-catenin、c-myc及cyclinD1 mRNA表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞核內(nèi)β-catenin mRNA、c-myc和cyclinD1 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)；與LPS組相比，加入TLR4阻斷劑和抑制劑DDK-1后，β-catenin、c-myc、cyclinD1 mRNA表達(dá)，均顯著下降(P<0.01)。見圖5。

圖1 BMSCs的生長(zhǎng)情況(×100)

2.4BMSCs中cyclinD1、c-myc及β-catenin蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，LPS組BMSCs細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)、c-myc和cyclinD1表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與LPS組相比，加入TLR4阻斷劑和抑制劑DDK-1后，β-catenin、c-myc和cyclinD1表達(dá)均明顯下降(P<0.01)。見圖4。

圖2 BMSCs增殖曲線

2.5BMSCs中TLR4蛋白表達(dá)情況 Western印跡檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(0.445±0.031)比較，LPS組TLR4(1.088±0.097)呈現(xiàn)高表達(dá)(P<0.01)。見圖5。

與對(duì)照組比較:1)P<0.01；與LPS組比較:2)P<0.01；下圖同圖3 BMSCs中β-catenin、c-myc、cyclinD mRNA表達(dá)情況

圖4 BMSCs中 β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白表達(dá)

圖5 BMSCs中TLR4的表達(dá)

3 討 論

經(jīng)典的 Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路，最初由Wnt蛋白與細(xì)胞表面的Wnt蛋白受體(Frizzled proteins和LRP5/6)相結(jié)合，信號(hào)傳遞入胞內(nèi)，穩(wěn)定β-catenin，然后將穩(wěn)定的β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，進(jìn)入細(xì)胞核后的β-catenin與淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子(Lef))或T細(xì)胞因子(Tcf))等轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，啟動(dòng)增殖相關(guān)目標(biāo)基因的表達(dá)，如cyclinD1、軸蛋白(axin)2、c-Myc等〔5〕。本研究結(jié)果表明，TLR4能通過Wnt/β-catenin

信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs增殖，為BMSCs臨床治療心肌梗死疾病提供了新的理論依據(jù)。

1Hua-Cho H，Bae YC，Jung JS.Role of toll-like receptors on human adipose derivedstromal cells〔J〕.Stem Cells，2006；24(12)：2744-52.

2Pevsner-Fischer M,Morad V,Cohen-Sfady M，etal.Toll-like receptors and their ligands control mesenchymal stem cell functions〔J〕.Blood，2007；109(4)：1422-32.

3Yin Y，Li F，Li S，etal.TLR4 influences hepatitis B virus related hepatocellular carcinoma by regulating the Wnt/β-catenin pathway〔J〕.Cell Physiol Biochem，2017；42(2)：469.

4龍仙萍，鄧文文，趙然尊，等.干擾Nrf2基因后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心肌梗死后心肌凋亡的影響〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015；37(13)：1319-24.

5Kim JH，Liu X，Wang J，etal.Wnt signaling in bone formation and its therapeutic potential for bone diseases〔J〕.Ther Adv Musculoskelet Dis，2013；5(1)：13-31.