謝小平 ，郭儀 ，李現(xiàn)才 ，陳任生 ，朱國民 ，揭志剛

(南昌大學第一附屬醫(yī)院，1.胃腸外科；2.病理科，南昌 330006)

直腸吻合口瘺是直腸癌術后最常見的并發(fā)癥之一，嚴重地影響了患者術后臨床轉歸，如何有效地預防和治療直腸癌術后吻合口瘺一直為臨床亟待解決的重要課題。預防性末端回腸造口是目前臨床上用于預防和治療直腸吻合口瘺的常用方法，研究顯示[1，2]，預防性末端回腸造口可有效地降低低位直腸癌術后吻合口瘺的發(fā)生率和再手術率；但是，也有學者[3]認為預防性回腸造口不僅不能預防直腸吻合口瘺的發(fā)生，而且有可能增加術后并發(fā)癥的風險。因此，對預防性回腸造口在直腸吻合口愈合中的作用迄今仍有爭議，為此，本課題對此進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用健康雄性SD大鼠36只，鼠齡 8-10 周，體重（220±20）g，購自南昌大學醫(yī)學院動物科學部；動物實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑和儀器 注射用戊巴比妥鈉粉針（上海新亞藥業(yè)有限公司），羥脯氨酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所)，Van Gieson染色液（北京索萊寶科技有限公司），醫(yī)用水銀血壓計（江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司），722型分光光度計 （上海光學儀器廠），光學顯微鏡 （日本，Olympus），美國雙杰電子天平（上海壘固儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型 全部大鼠隨機分為4組，每組15只大鼠，組內(nèi)再按術后3d、7d和10d處理不同分為3小組，每小組各5只大鼠。全部大鼠術前禁食12h后稱重，以2%苯巴比妥鈉溶液(60mg/kg)腹腔注射麻醉，腹部剃毛、消毒、鋪巾，取下腹長約2cm的正中切口進入腹腔：⑴觀察組：切斷直腸后用0號絲線對端吻合，吻合口旁置自制的雙套管一根，自腹壁引出固定；再距回盲部約2cm切斷小腸，遠端封閉，近端外置腸造口。⑵腸造口組：方法同上，于吻合口旁注入1ml生理鹽水，不置腹腔引流管。⑶非腸造口組：切斷直腸后吻合。⑷腸瘺組：直腸吻合時預留約0.3cm不吻合，次日行回腸造口和放置腹腔引流管沖洗。術后全部大鼠自由飲水，12h后少量進食，術后1d用生理鹽水負壓沖洗腹腔雙套管至清亮，每天2次，共3d。

1.2.2 指標觀察和方法 觀察大鼠術后活動、精神狀態(tài)、肛門或腸造口排糞、引流管引流通暢等情況，按處理時間點剖腹，檢查大鼠腹腔粘連和吻合口愈合程度，切取吻合口兩側約3cm腸襻，剪除周圍粘連脂肪組織，清洗后，一端腸管用絲線結扎，另一端插入無針頭的頭皮針導管并結扎，與去除袖帶的血壓計氣管相連，腸襻置于生理鹽水中，緩慢充氣，若見水中氣泡，記下水銀柱刻度即為吻合口破裂壓。切取術后3d、7d和10d各處理時間點大鼠腸吻合口及1cm的腸襻，置-60℃保存。按羥脯氨酸檢測試劑盒說明書操作，精確稱取吻合口腸壁100mg，剪碎，勻漿，加入堿水解液、水浴，調(diào)節(jié)pH值至 6.8，加入蒸餾水至4ml和活性炭，以3500r/min離心，取上清液1ml為實驗液，以蒸餾水為空白管、5μg/ml標準羥脯氨酸液為標準管，分別依次加入氯胺T、過氯酸和對二甲胺基苯甲酸各0.5ml，混勻、置 60℃水浴 15min后，離心，分別取上清液于550nm處，1cm光徑，測各管OD值。按公式計算組織羥脯氨酸含量：羥脯氨酸含量（μg/mg濕重）=（實驗管OD值-空白管OD值）/（標準管OD值-空白管 OD 值）×標準品含量 （5μg/ml）×水解液體積(ml)/組織濕重（mg）。⑷病理學檢查 切取吻合口組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察吻合口組織炎性細胞浸潤情況；另取石蠟切片，采用Van Gieson染色法[4]行膠原染色，光鏡下觀察并拍照，觀察組織膠原纖維含量和分布。染色判斷：膠原纖維呈鮮紅色，肌纖維和紅細胞為黃色，細胞核為藍黑或灰色。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，全部數(shù)據(jù)以（x±s）表示，計量資料采用F檢驗，兩兩比較采用 Student檢驗，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 60只大鼠術后死亡3只，其中，觀察組1只，死于手術當日下午，腸瘺組2只，術后次日發(fā)現(xiàn)死亡，死亡原因可能與麻醉和手術創(chuàng)傷有關；死亡大鼠及時補做。其余大鼠均成活，進食、飲水正常、精神靈敏、活躍；術后2h小腸造口或肛門開始排糞；引流管沖洗通暢；術后3d、7d、10d剖腹，觀察組、腸造口組及腸瘺組腹腔及吻合口旁粘連明顯，非腸造口組腹腔粘連較輕，無積液。

2.2 吻合口破裂壓的變化 術后各組隨時間延長吻合口破裂壓均逐漸增加（P<0.05）；而在術后3d、7d、10d，觀察組的吻合口破裂壓雖高于腸造口組和非腸造口組，但兩者比較并無統(tǒng)計學差異（P>0.05），但明顯高于腸瘺組(P<0.05)。見表1。

表1 術后各組吻合口破裂壓的變化（x±s，mmHg）

2.3 組織羥脯氨酸含量的變化 術后各組吻合口組織羥脯氨酸的含量隨時間的延長而增加 （P<0.05）；而在術后 3d、7d、10d，觀察組組織羥脯氨酸含量分別與腸造口組和非腸造口組比較均無明顯差異（P>0.05），但較腸瘺組明顯升高（P<0.05）。

表2 術后各組腸吻合口的組織羥脯氨酸含量變化（x±s，μg/g）

2.4 病理變化 光鏡下觀察，術后3d，各組黏膜下層炎癥細胞浸潤數(shù)量較多，其中，腸瘺組明顯，其次為非腸造口組和腸造口組，觀察組最少；術后7d各組炎癥細胞浸潤明顯減輕，但是，腸瘺組仍較多，而至術后10d，各組基本上無明顯炎癥細胞浸潤。Van Gieson膠原染色顯示：術后3d，各組染色膠原較少，其中，腸瘺組染色膠原稀疏；而至術后7d和10d，各組染色膠原逐漸增加，觀察組染色膠原增多，其次為腸造口組和非腸造口組，而腸瘺組最少，且分布較雜亂（見圖1）。

圖1 紅色為膠原纖維，藍色為炎癥細胞

3 討論

保肛手術是低位直腸癌根治性手術患者的迫切要求，但是，術后較高的直腸吻合口瘺的發(fā)生率是一直困擾臨床的難題之一[5]。自2007年瑞典學者Matthiessen P等[6]首次報告預防性腸造口可以有效地降低低位直腸癌術后吻合口瘺的發(fā)生率以來，預防性腸造口術已在臨床上被廣泛應用，但是，對其預防術后直腸吻合口瘺的作用也一直存在爭議[7-11]。有研究[12，13]認為預防性腸造口能明顯降低高危人群直腸吻合口瘺的發(fā)生率和再手術率以及吻合口瘺相關的死亡率，但也有研究[7]認為預防性腸造口不僅不能降低術后直腸吻合口瘺的發(fā)生率，反而會延緩了患者術后康復，增加了術后腸梗阻、腹腔感染和腸穿孔等并發(fā)癥的發(fā)生率。本研究發(fā)現(xiàn)：60只大鼠除術后3只發(fā)生與手術相關的死亡外，其余成活的大鼠中，除腸瘺組外，另外3組大鼠均無一例出現(xiàn)吻合口瘺，但是，觀察組、腸造口組及腸瘺組大鼠術后腹腔及吻合口處小腸和網(wǎng)膜粘連致密，而非腸造口組腹腔粘連較輕，提示：預防性回腸造口有增加大鼠術后腹腔粘連及腸梗阻的風險。

腸吻合口的愈合涉及到腸黏膜上皮細胞遷移和分化、新生血管的生成和基質膠原合成等多個環(huán)節(jié)，其中，膠原合成量在腸吻合口愈合中起重要作用。腸吻合口的膠原主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原，并經(jīng)膠原酶和明膠酶作用降解；研究表明[14]：腸吻合后3h即開始合成膠原，并逐漸增加，至第4周恢復正常，并同時伴隨有膠原的降解。腸吻合口愈合的強度則取決于膠原合成和降解的平衡；腸吻合口破裂壓則是評估吻合口愈合強度的重要指標，而測定組織羥脯氨酸的含量可反映組織愈合過程中膠原合成情況[15]。研究表明：腹腔感染是影響腸吻合口羥脯氨酸合成的重要因素。Thornton等[16]研究發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，腹腔感染后大鼠，結腸吻合口于術后24h膠原合成量明顯下降，96h后恢復正常。本研究發(fā)現(xiàn)：各組大鼠隨著術后時間的延長，腸吻合口破裂壓也逐漸增加，但腸瘺組的吻合口破裂壓始終低于其它3組（P<0.05），其組織羥脯氨酸含量也相應地明顯降低（P<0.05）；觀察組的吻合口破裂壓分別與腸造口組和非腸造口組比較并無顯著差異（P>0.05），并且，其組織羥脯氨酸含量也較腸造口組和非腸造口組無統(tǒng)計學差異（P>0.05），其原因可能為腸吻合口瘺引起腹腔嚴重感染，抑制了吻合口組織羥脯氨酸的合成[17，18]，致使吻合口組織愈合延遲；而預防性回腸造口術后早期轉流糞水及減輕吻合口腸腔張力，減輕了局部感染，有利于組織膠原的合成和分泌[16-19]。非腸造口組盡管術后早期吻合口有糞水聚積誘發(fā)吻合口炎的風險，但是，其炎癥反應程度較輕，吻合口膠原的合成可能并未被抑制，致使其吻合口破裂壓與腸造口組比較并無明顯差異，提示，術中預防性腸造口相對于非保護性腸造口可能在預防直腸吻合術后吻合口瘺的發(fā)生方面并無明顯優(yōu)勢。

本研究光鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)，術后3d，各組大鼠腸吻合口均存在不同程度的炎癥細胞浸潤，其中，腸瘺組的黏膜下炎癥細胞浸潤最多，其次為非腸造口組、腸造口組，觀察組最少；但是，隨著術后時間的延長，各組大鼠吻合口炎癥細胞浸潤程度也逐漸減輕，至術后10d，各組基本恢復正常；采用Van Gieson染色法對各組大鼠吻合口組織膠原染色研究顯示，隨著術后時間的延長，吻合口膠原的含量也逐漸增多；在術后3d，各組吻合口膠原含量均較少，而至術后7d和10d，觀察組的膠原含量最多，腸瘺組最少，并且，膠原分布較雜亂或呈束狀；這些病理變化說明，吻合口組織的炎性反應程度可能是影響組織膠原合成和分泌的重要因素，采用預防性腸造口雖然有可能減輕直腸吻合口的炎癥反應，但是相對于非腸造口的大鼠，并不能預防術后吻合口瘺的發(fā)生，反而有增加了術后腹腔粘連的風險[20]，提示直腸吻合口瘺的發(fā)生可能還與其它的病理因素有關。