范彩霞

(江西省撫州市中心血站，撫州 344000)

為了確保臨床用血安全，提高窗口期和變異病毒株的檢出，最大限度地減少方法學引起的差異，國家衛(wèi)計委強烈地要求全國的采供血機構(gòu)需全面普及核酸檢測。撫州市中心血站從2015年6月開始嚴格按照國家衛(wèi)生和計劃生育委員會下發(fā)的《關(guān)于做好血站核酸檢測工作的通知》的要求籌建核酸實驗室，2016年全面開展 HBV、HCV和HIV(1型)核酸檢測用于臨床用血的篩查。本文通過對2016年我站的獻血者20763例標本酶聯(lián)免疫吸附聯(lián)合核酸檢測結(jié)果進行分析，探討核酸檢測用于獻血者臨床輸血安全篩查的重要性。

1 材料與方法

1.1 標本來源 采集2016年1-12月?lián)嶂菔兄行难?0763位無償獻血者血漿。所有無償獻血者均符合我國GB18467《獻血者健康檢查要求》的標準。采血后留取真空抗凝管5ml，所有標本均在冷鏈保證情況下送到站內(nèi)，低溫離心保存，在72h內(nèi)完成輸血前檢測。

1.2 儀器與試劑 ELISA檢測試劑盒由廈門新創(chuàng)科技有限公司和北京萬泰科技有限公司提供。ChiTaSBSS1200全自動核酸提取儀 （蘇州新波生物技術(shù)有限公司）及配套試劑和ABI 7500實時熒光定量PCR儀 （愛普拜斯應用生物系統(tǒng)公司）。HBV、HCV和HIV(1型)核酸檢測試劑盒Real Time-PCR由上海浩源生物科技有限公司提供。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 ELISA血清學檢測 用廈門新創(chuàng)和北京萬泰二種ELISA檢測試劑盒同時對20763份無償獻血者標本進行HBV抗原、HCV和HIV抗體檢測。一種ELISA方法檢出陽性或二種均為陽性的標本剔除。兩次ELISA該三項指標均為陰性且其他項目檢測合格的樣本進行8混樣混合后做HBV-DNA、HCV-RNA、HIV(1型)-RNA核酸檢測。

1.4 核酸提取和PCR擴增 參照試劑盒說明書用ChiTaSBSS1200系統(tǒng)及配套試劑進行熒光PCR檢測HBV-DNA、HCV-RNA、HIV(1型)-RNA 病毒核酸。病毒核酸提取采用磁珠法，血漿標本及內(nèi)對照經(jīng)裂解液處理后釋放出基因組核酸，加入表面包被有二氧化硅的磁珠顆粒，在高鹽環(huán)境下帶負電荷的核酸吸附到帶正電荷的磁珠顆粒表面。純化的病毒及內(nèi)對照核酸在洗脫液提供的環(huán)境及特定溫度下從磁珠顆粒表面洗脫下來成為PCR擴增的模板。PCR擴增檢測采用TagMan熒光探針標定技術(shù)。HBV、HCV、HIV(1型)病毒核酸擴增在同一管內(nèi)分別采用不同熒光染料標記的探針，故可同時檢測該3種病毒核酸。在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下HCV-RNA/HIV(1型)-RNA/內(nèi)對照RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再與HBV-DNA/內(nèi)對照DNA一同作為模板在TaqDNA聚合酶的作用擴增病毒核酸的保守區(qū)域和內(nèi)對照特定區(qū)域。TaqDNA聚合酶5′-3′外切酶活性切割反應系統(tǒng)中帶熒光標記的TaqMan探針產(chǎn)生熒光信號，隨著PCR反應的進行，熒光信號不斷積累。Real Time-PCR法通過檢測達到和超過熒光閾值的信號給出標本的陰陽性結(jié)果。核酸檢測陽性樣本送國家衛(wèi)計委臨床檢驗中心做比對試驗。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測結(jié)果 20763份無償獻血標本中有20426份合格標本用于核酸檢測。其中不合格標本為HBsAg陽性標本194份、抗-HCV陽性標本34份、抗-HIV-1/2陽性標本13份。其他項目不合格標本共99份，其中抗-TP 46份，ALT53份（見表1）。

2.2 核酸檢測結(jié)果 對20426份血清學檢測結(jié)果合格的標本進行核酸檢測結(jié)果為核酸反應性標本50例（HBV-DNA49例及HIV(1型)-RNA 1例），核酸反應性標本陽性率2.45‰。最后將這50例核酸反應性標本連同血漿袋一起送往國家衛(wèi)計委臨檢中心做比對試驗，其結(jié)果是49份HBV-DNA陽性標本中有45份為陽性，4份為陰性；1份HIV(1型)-RNA陽性標本經(jīng)國家衛(wèi)計委臨檢中心檢測為陰性（見表2），核酸檢測陽性符合率為90%，符合國家相關(guān)要求。

3 討論

從表1、2中可以看出核酸檢測聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附實驗比單純的ELISA檢測更安全。酶聯(lián)免疫吸附法的檢測方法較為局限性，以窗口期進行，細胞抗原、抗體的蛋白結(jié)構(gòu)易變性，純粹的抗體、抗原ELISA檢測還是具有一定的輸血安全風險性。而NAT檢測的是病毒核酸。兩者在檢測原理及方法上均存在差異。本實驗室曾將ELISA檢測抗-HCV陽性的標本進行NAT檢測，結(jié)果并非都是NAT陽性，所以兩種方法的檢測結(jié)果有互補之效。增加NAT檢測是對ELISA的有效補充，能夠使現(xiàn)有的獻血體系更加完善，使輸血傳播疾病的風險降到最低。為了保證血液質(zhì)量及輸血安全，在獻血者血液篩查的兩遍酶免檢測的基礎上增添核酸檢測是很有必要的[1-4]。

2016年采集的20763份標本中，ELISA檢測合格標本數(shù)為20426份，陽性標本數(shù)為337份，其中包括HBsAg陽性標本194份；有1份標本既是HBsAg陽性又是抗-TP陽性標本；有2份標本既是HBsAg陽性又是ALT不合格標本；ALT不合格標本53份，分別占不合格標本的58.46%和16.32%。由此可見，在我們的無償獻血人群中感染乙肝的人群占了較大的比例[5]，其次是ALT不合格的人群。

表1 2016年撫州市中心血站無償獻血者ELISA法檢測結(jié)果表

表2 50例核酸反應性標本檢測結(jié)果及國家衛(wèi)計委臨檢中心檢測結(jié)果對照表

另從核酸及ELISA檢測結(jié)果分析表明，在乙型肝炎病毒 （HBV）感染檢測中，NAT除可縮短HBV感染檢測的窗口期外，還可減少HBV急性感染恢復期、慢性隱匿性HBV感染以及變異病毒株感染的漏檢。有文獻報道[6，7]，核酸檢測技術(shù)平均可將HBV、HCV、HIV感染 “窗口期”由原來的56d、82d、22d， 縮短至 33d、22d、11d， 分別縮短 40%、73%和50%。由此可見，核酸檢測 （nucleic acid test，NAT）可以有效地縮短病毒特異抗原和抗體免疫測定的“窗口期”。

綜上所述，核酸檢測技術(shù)能有效地降低酶聯(lián)免疫法漏檢造成的輸血風險，故核酸檢測和酶聯(lián)免疫檢測相結(jié)合做為血液篩查檢測的重要手段，可以大大地提高輸血安全。