王娣，柯春林，謝海偉，曹珂珂，李妍，許暉

(蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

百里香(Thymusmongolicus)屬唇形科屬，在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江以北區(qū)域，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)確定它為食品調(diào)味品之一[1-4]，可用于烹飪時(shí)除腥提鮮，有較高的食用價(jià)值。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)百里香屬植物莖葉中富含黃酮、百里香酚等活性成分，可用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[5-9]。但百里香活性成分易受外界環(huán)境影響而揮發(fā)和氧化，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。微膠囊技術(shù)使囊心被壁材包埋，與外界環(huán)境隔離，免受不良因素造成的影響[10-14]。酵母細(xì)胞是天然微膠囊原料，小分子物質(zhì)可以滲透進(jìn)入細(xì)胞形成微膠囊[15]。本文以安琪酵母為壁材，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化百里香黃酮微膠囊制備工藝，研究不同因素對(duì)其微膠囊形成的影響，并對(duì)黃酮微膠囊進(jìn)行抑菌作用初探，以期為百里香活性物質(zhì)的提取利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百里香(市售，含水量10.5%)：粉碎過(guò)篩(60目)備用；聚酰胺樹(shù)脂(30～60目)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；安琪活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；蘆丁標(biāo)品(純度≥95%)、無(wú)水乙醇(分析純)、氯化鈉(分析純)：中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。

大豆油：實(shí)驗(yàn)室自榨提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)：蚌埠學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，編號(hào)：1.10753)：中科院微生物所購(gòu)買；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB323電子天平 上海海康電子儀器廠；XFB-200高速中藥粉碎機(jī) 吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；CHR-ST冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；MZKR022-R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；SHA-B恒溫震蕩器 常州電器有限公司；DL-360A超聲清洗器 上海之信儀器有限公司；RE200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；YXQ-LS-50G滅菌鍋 上海博訊有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 百里香黃酮提取液制備和含量測(cè)定

1.3.1.1 百里香黃酮提取液的制備

準(zhǔn)確稱取10.0 g 百里香粉，加入70%乙醇，超聲波50 ℃輔助提取百里香黃酮，抽濾后的濾液經(jīng)聚酰胺樹(shù)脂分離純化，90%乙醇洗脫，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL備用。

1.3.1.2 百里香黃酮含量的檢測(cè)

a.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 g，用30%乙醇定容至100 mL容量瓶中。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，各加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液6 min(還原)，加0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液6 min(絡(luò)合)，再加4 mL 1 mol/L NaOH溶液，用30%乙醇定容于10 mL容量瓶中，搖勻顯色15 min，510 nm處測(cè)吸光度[16]。得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.0115x+0.0063，R2=0.9997，具有良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

b.黃酮提取液含量檢測(cè)

準(zhǔn)確吸取樣液1 mL，置于10 mL容量瓶中，按步驟a測(cè)定吸光度，計(jì)算得到黃酮含量。

1.3.2 百里香黃酮微膠囊的制備

1.3.2.1 酵母細(xì)胞預(yù)處理

稱取一定量的安琪活性干酵母，加入10倍量的5% NaCl溶液，50 ℃水浴恒溫振蕩24 h，離心，無(wú)菌水洗3次，冷凍干燥，備用。

1.3.2.2 百里香黃酮微膠囊的制備方法

將百里香黃酮濃縮液按比例加入預(yù)處理好的酵母細(xì)胞中，恒溫振蕩，離心，無(wú)菌水洗3 次，冷凍干燥得百里香黃酮微膠囊。

1.3.3 黃酮微膠囊的制備工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

以包埋率為指標(biāo)，研究不同芯壁比、包埋時(shí)間以及包埋溫度對(duì)百里香黃酮微膠囊制備的影響。

a.芯壁比對(duì)包埋率的影響

以1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1 不同的芯壁比(g/g)將百里香黃酮濃縮液加到預(yù)處理后的酵母中，40 ℃恒溫水浴振蕩6 h，5000 r/min離心10 min，冷凍干燥，測(cè)定百里香黃酮包埋率。

b.包埋時(shí)間對(duì)包埋率的影響

以芯壁比3∶1(g/g)將百里香黃酮濃縮液加入預(yù)處理后的酵母中，40 ℃恒溫振蕩2，4，6，8，10 h，5000 r/min離心10 min，冷凍干燥，測(cè)定百里香黃酮包埋率。

c.包埋溫度對(duì)包埋率的影響

以芯壁比3∶1(g/g)將百里香黃酮濃縮液加到預(yù)處理后酵母中，不同溫度30，40，50，60，70 ℃下振蕩6 h，5000 r/min離心10 min，冷凍干燥，測(cè)定百里香黃酮包埋率。

百里香黃酮包埋率=1-未包埋的游離黃酮量加入的總黃酮量×100%。

1.3.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

采用Design-Expert V8.0.6軟件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以芯壁比(A)、包埋時(shí)間(B)、包埋溫度(C)為自變量，百里香黃酮包埋率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.4 百里香黃酮微膠囊抑菌活性研究

接種斜面細(xì)菌菌落至50 mL滅菌冷卻的TSB中，120 r/min 37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，取0.1 mL培養(yǎng)液接入10 mL TSB中繼續(xù)培養(yǎng)8 h，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心后用pH 7.2的PBS(0.01 mol/L)洗滌2次，懸浮菌體濃度至106～107cfu/mL備用。精確稱取百里香黃酮微膠囊5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 mg，紫外滅菌20 min，置于10 mL菌懸液中處理10 min，以不加微膠囊作為對(duì)照處理，處理后的液體吸取0.10 mL稀釋液涂布于TSA平皿中(n=3)，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算菌落數(shù)，計(jì)算百里香黃酮微膠囊的抑菌率。

抑菌率(%)=空白平均菌落數(shù)-微膠囊處理后平均菌落數(shù)空白平均菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2 芯壁比對(duì)百里香黃酮包埋率的影響Fig.2 The effect of ratio of core material and wall material on embedding rate of thyme flavonoids

由圖2可知，芯壁比(g/g)的變化對(duì)百里香黃酮包埋率的影響較大，隨著芯壁比的增大，包埋率出現(xiàn)快速上升，到3∶1 時(shí)包埋率最大，達(dá)到飽和。綜合考慮，選擇芯壁比3∶1左右為宜。

圖3 包埋時(shí)間對(duì)百里香黃酮包埋率的影響Fig.3 The effect of embedding time on embedding rate of thyme flavonoids

由圖3可知，隨著包埋時(shí)間的延長(zhǎng)，百里香黃酮的包埋率呈上升趨勢(shì)，在6 h 時(shí)百里香黃酮的包埋率達(dá)到最高，之后趨于穩(wěn)定，基本保持不變。綜合考慮，選取包埋時(shí)間6 h 左右為宜。

圖4 包埋溫度對(duì)百里香黃酮包埋率的影響Fig.4 The effect of embedding temperature on embedding rate of thyme flavonoids

由圖4可知，隨著包埋溫度的增加，百里香黃酮包埋率先略上升后下降，可能是開(kāi)始時(shí)擴(kuò)散速率隨著溫度的升高而增大，導(dǎo)致包埋率出現(xiàn)上升，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高超過(guò)50 ℃時(shí)，高溫使部分酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)變性失活，同時(shí)高溫對(duì)百里香黃酮可能也有一定程度的破壞，因此，選取40 ℃左右為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface experiment

2.2.2 數(shù)型的建立與響應(yīng)面方差分析結(jié)果

采用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到的百里香黃酮微膠囊包埋率與各因變量的模擬方程為：Y=68.24+0.96A+0.46B-0.48C-2.31A2-1.50B2-0.84C2-0.39AB-0.050AC-0.83BC?；貧w方程拋物面開(kāi)口向下，具有極大值點(diǎn)，可以對(duì)百里香黃酮微膠囊工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[17,18]。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic response surface regression model

注：*，P<0.05表示差異顯著；**，P<0.01表示差異極顯著。

由表3可知，該回歸模型的P<0.0001，極顯著；方程失擬項(xiàng)值為0.0805>0.05，不顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合度比較好，可以代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)百里香黃酮微膠囊工藝試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。R2=0.9795說(shuō)明該回歸模型的擬合度比較好；模型調(diào)整系數(shù)RAdj2=0.9532，說(shuō)明該模型的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間相關(guān)性較好；模型精密度為19.959，說(shuō)明該模型是可行的[19]。由表3中F值的大小判斷各因素對(duì)百里香黃酮微膠囊包埋率影響的強(qiáng)弱，F(xiàn)值越大，對(duì)包埋率影響作用越強(qiáng)[20-23]。各因素影響大小為A(芯壁比)>C(包埋溫度)>B(包埋時(shí)間)。其中A對(duì)百里香黃酮包埋率的影響極顯著(P<0.01)，B，C對(duì)百里香黃酮包埋率的影響顯著(P<0.05)。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

等高線圖能直觀反映影響因素之間交互作用是否顯著，圓形表明交互作用不顯著，橢圓形則表明交互作用顯著[24]。等高線和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互對(duì)百里香黃酮包埋率影響的等高線和響應(yīng)面圖

由圖5中a可知，隨著芯壁比和包埋時(shí)間的增加，百里香黃酮包埋率先升高后緩慢降低。適當(dāng)?shù)卦龃笮颈诒瓤梢蕴岣甙倮锵泓S酮包埋率。由圖5中b可知，隨著芯壁比與包埋溫度的增加，百里香黃酮包埋率同樣出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。由圖5中c可知，隨著包埋時(shí)間和包埋溫度的增加，百里香黃酮包埋率先快速增加后下降。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert V8.0.6軟件預(yù)測(cè)百里香黃酮微膠囊制備的最優(yōu)工藝條件為芯壁比3.19∶1，包埋時(shí)間6.48 h，包埋溫度35.9 ℃，在此條件下百里香黃酮微膠囊包埋率理論上可達(dá)68.49%。為操作方便，將最佳工藝條件修正為芯壁比3∶1，包埋時(shí)間6.5 h，包埋溫度36 ℃，百里香黃酮微膠囊包埋率平均值為(68.50±0.36)%(n=3)，與預(yù)測(cè)值接近。

2.3 百里香黃酮微膠囊的抑菌活性研究

百里香黃酮微膠囊的抑菌作用見(jiàn)表4～表6。

表4 百里香黃酮微膠囊濃度對(duì)金黃色葡萄球菌抑制率的影響Table 4 Effect of thyme flavonoid microcapsule content on inhibitory rate of S.aureus

表5 百里香黃酮微膠囊濃度對(duì)單增李斯特菌抑制率的影響Table 5 Effect of thyme flavonoid microcapsule content on inhibitory rate of L.monocytogenes

表6 百里香黃酮微膠囊濃度對(duì)大腸桿菌抑制率的影響Table 6 Effect of thyme flavonoid microcapsule content on inhibitory rate of E.coli

試驗(yàn)結(jié)果顯示：百里香黃酮微膠囊對(duì)3種常見(jiàn)食品污染菌均有一定抑制作用。當(dāng)微膠囊量添加較小時(shí)，對(duì)E.coli和L.monocytogenes的抑制效果均不明顯；但隨著百里香黃酮微膠囊濃度的增加，對(duì)S.aureus，E.coli和L.monocytogenes的抗菌能力在逐漸增強(qiáng)。經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析，不同濃度的百里香黃酮微膠囊對(duì)3種細(xì)菌抑制率的影響具有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)黃酮微膠囊濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，對(duì)S.aureus，E.coli和L.monocytogenes的抑制率(%)分別為98.50±0.07，87.10±0.05和93.20±0.13，再繼續(xù)增加黃酮微膠囊的量，細(xì)菌抑制率增加不明顯。數(shù)據(jù)分析對(duì)比得出：在黃酮微膠囊濃度相同時(shí)，對(duì)S.aureus的抑制率要比E.coli和L.monocytogenes的抑制率高，黃酮微膠囊對(duì)細(xì)菌的抑菌效果大小為：S.aureus>L.monocytogenes>E.coli。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)百里香黃酮微膠囊進(jìn)行制備，結(jié)果表明芯壁比對(duì)包埋率的影響最大，芯壁比>包埋溫度>包埋時(shí)間，得到百里香黃酮微膠囊制備最優(yōu)條件為芯壁比3∶1，包埋時(shí)間6.5 h，包埋溫度36 ℃，包埋率為(68.50±0.36)%(n=3)。百里香黃酮微膠囊抑菌作用研究表明：百里香黃酮微膠囊對(duì)S.aureus，E.coli和L.monocytogenes均有一定抑制作用，抑制作用大小為S.aureus>L.monocytogenes>E.coli。

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