王娣，李雨晴，程柏，李妍，曹珂珂

(蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

百里香是由國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織公布的香辛料之一，廣泛分布于非洲北部、歐洲及亞洲溫帶，百里香屬唇形科植物，有很強(qiáng)的芳香氣味，有消炎、防腐等作用[1]。全世界百里香屬植物大約有300～400種，我國(guó)百里香屬植物主要分布于西北，資源較為豐富[2]。百里香中含有豐富的活性成分，例如黃酮、多酚和多糖等，具有一定開發(fā)前景[3]。植物多糖具有生物活性，具體包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂等保健作用，越來(lái)越受到專家的關(guān)注[4-9]。本文采用超聲波輔助堿水法從百里香全草中提取多糖，以提取pH、料液比、提取時(shí)間為影響因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，并對(duì)提取的多糖進(jìn)行抗氧化活性研究，以期為我國(guó)百里香資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

百里香全草(Thymusmongolicus)：購(gòu)于陜西省吳起縣，自然風(fēng)干，置于陰涼干燥處避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、Vc標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；H2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4、C2H5OH、H2O2、FeSO4、C7H6O3等：均為分析純，購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

LD-T300A高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 上海頂帥電器有限公司；SK-1漩渦振蕩器 金壇市白塔新寶儀器廠；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SB-3200DTD超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XMA-600電熱鼓風(fēng)干燥箱 余姚市亞泰儀表有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 百里香的預(yù)處理

百里香干燥粉碎后過(guò)60目篩，脫脂后于棕色瓶中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 多糖測(cè)定方法

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)計(jì)算多糖的提取率。

1.4.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備：先將葡萄糖在60 ℃的條件下干燥至恒重，然后精確稱取葡萄糖0.100 g，加超純水溶解于100 mL的容量瓶中，定容，搖勻。分別吸取0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶中，用超純水定容，搖勻。吸取1.0 mL不同濃度的葡萄糖溶液置于試管中，加入80%苯酚溶液50 μL，然后加入5 mL的濃硫酸溶液，混勻后靜置5 min，以超純水作為對(duì)照，在490 nm處下測(cè)定反應(yīng)液吸光度，每個(gè)樣品平行試驗(yàn)3次，取平均值，并且用葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 百里香多糖的提取方法

稱取一定量的百里香，超聲波300 W，50 ℃恒定條件下，在一定pH下提取一定時(shí)間，4000 r/min下離心10 min，得上清液，用苯酚-硫酸法檢測(cè)百里香多糖的提取率。

1.4.5 單因素試驗(yàn)

1.4.5.1 提取時(shí)間對(duì)百里香多糖提取率的影響

稱取0.50 g百里香5份，加入20.0 mL超純水，用緩沖溶液調(diào)pH為10.0。在超聲波300 W、50 ℃恒定條件下提取5，10，15，20，25 min，4000 r/min下離心10 min，檢測(cè)得到百里香多糖的提取率。

1.4.5.2 料液比對(duì)百里香多糖提取率的影響

稱取0.50 g百里香5份，分別加入10，15，20，25，30 mL超純水，用緩沖溶液調(diào)pH為10.0。在超聲波300 W、50 ℃恒定條件下提取10 min，4000 r/min離心10 min，檢測(cè)得到百里香多糖的提取率。

1.4.5.3 pH對(duì)百里香多糖提取率的影響

稱取0.50 g百里香5份，按照1∶40的料液比，用緩沖溶液調(diào)pH為10.0，11.0，12.0，13.0，14.0。在超聲波300 W、50 ℃恒定條件下提取10 min，4000 r/min下離心10 min，檢測(cè)得到百里香多糖的提取率。

1.4.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以提取液中百里香酚的含量作為考察指標(biāo)進(jìn)行分析，試驗(yàn)因素及水平編碼見2.3.1中表1。以提取pH、料液比、時(shí)間為考察因素，選取合適的因素水平，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平回歸試驗(yàn)，使用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

1.4.7 百里香多糖的抗氧化作用研究

1.4.7.1 百里香多糖純化

將百里香多糖提取液加入50%乙醇，4 ℃靜置12 h，抽濾，取濾液,再加入70%乙醇，放置于冰箱中，4 ℃靜置12 h，抽濾，取濾液，用丙酮與濾液(4∶1)充分震蕩，靜置，取下層液，濃縮后冷凍干燥，得純化多糖[10]。

1.4.7.2 清除DPPH自由基能力的測(cè)定[11,12]

將純化后的百里香多糖，配制成質(zhì)量濃度分別為0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mg/mL的百里香多糖溶液后，分別取2 mL上述濃度的多糖溶液放入6支試管中，再分別加入2.0 mL質(zhì)量濃度為0.2 mmol/L DPPH溶液，避光靜置30 min后，在517 nm處測(cè)得其吸光度數(shù)值，用Vc作為對(duì)照。DPPH自由基的清除率計(jì)算公式為：

清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%。

式中：A0為未加樣品時(shí)DPPH溶液的吸光值；A1為樣品溶液的吸光值；A2為加入樣品后DPPH溶液的吸光值。

1.4.7.3 清除OH自由基能力的測(cè)定[13,14]

將超聲波提取的百里香多糖冷凍干燥成粉狀，配制成質(zhì)量濃度分別為1，2，3，4，5，6，8，10 mg/mL的百里香多糖溶液，分別加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L 乙醇-水楊酸，加入適量的超純水，最后加入8 mmol/L H2O2后混勻，在510 nm下測(cè)定其吸光度，用Vc作為對(duì)照。OH自由基清除率計(jì)算公式為：

清除率=[A0-(AX-AX0)]/A0×100%。

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度數(shù)值，AX為加樣品的吸光度數(shù)值，AX0為不加H2O2的吸光度數(shù)值。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.752x+0.0102(R2=0.9999)，在0.05～0.25 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，葡萄糖濃度與吸光度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2 百里香多糖提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)百里香多糖提取率的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)百里香多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extracion rate of thyme polysaccharides

由圖2可知，百里香多糖提取率隨提取時(shí)間的增加先上升再下降，當(dāng)提取時(shí)間在10 min時(shí)，百里香多糖的提取率最大，10 min后，百里香多糖的提取率開始明顯下降，可能是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)破壞了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。綜合考慮，提取時(shí)間10 min為最適提取時(shí)間。

2.2.2 料液比對(duì)百里香多糖提取率的影響

圖3 料液比對(duì)百里香多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate of thyme polysaccharides

由圖3可知，料液比由1∶20增至1∶40時(shí)，多糖提取率逐漸增加，隨后隨著料液比再增加，百里香多糖的提取率反而開始下降。綜合考慮，百里香多糖提取料液比為1∶40時(shí)最適宜。

2.2.3 pH對(duì)百里香多糖提取率的影響

圖4 pH對(duì)百里香多糖提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the extraction rate of thyme polysaccharides

由圖4可知，隨著pH的不斷增大，百里香多糖的提取率不斷升高并逐漸趨于平穩(wěn)，綜合考慮，選擇pH 13為百里香多糖提取的最適pH。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼、水平及結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

注：表中百里香酚提取率為均值(N=3)。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

以百里香多糖提取率為考察指標(biāo)，提取時(shí)間、料液比、pH為自變量，回歸擬合后得到多糖提取率的回歸方程式模型為：Y=5.36+0.15A+0.22B+0.31C-0.58A2-0.85B2-0.39C2-0.053AB-0.09AC+0.077BC。

由表3方差分析可知模型的P<0.0001，表明該模型方差極顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示提取時(shí)間、提取pH對(duì)百里香多糖提取的影響極顯著，料液比的影響顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2是極顯著的，R2=99.21%表明回歸方程能較好地描述各單因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。根據(jù)二次回歸方程的系數(shù)絕對(duì)值的大小C>B>A，可判斷3個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響大小為：pH對(duì)百里香多糖提取率的影響效果最為顯著，然后依次為提取時(shí)間、料液比。通過(guò)軟件分析得到超聲提取百里香多糖的最佳工藝條件：提取時(shí)間為10.5 min，料液比為1∶40.8，pH為13.4，提取率為5.45%。

2.3.2 三維曲面圖

響應(yīng)面圖能直觀地反映出各個(gè)因素間的交互作用，通過(guò)多元回歸方程做響應(yīng)面圖，見圖5。

A料液比與時(shí)間

B料液比與pH

C時(shí)間與pH

由圖5可知，3個(gè)響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，同時(shí)等高線最小橢圓的中心在所選的-1～1范圍內(nèi)，說(shuō)明響應(yīng)值(百里香多糖提取率)在3個(gè)因素設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)存在最大值。由圖5A可知，在一定的提取時(shí)間內(nèi)，百里香多糖提取率隨著料液比的增大而增大，但達(dá)到一定程度后，多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由圖5B可知，多糖的提取率隨著pH和料液比的增加先增大后減少。由圖5C可知，多糖提取率隨著pH與提取時(shí)間的增加先增加后減少。由圖5B和圖5C等高線可以看出，等高線的橢圓形較明顯，從而證明了料液比與pH、提取時(shí)間與pH這兩組因素的交互作用顯著。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)論驗(yàn)證

由響應(yīng)面法分析得到的百里香多糖提取的最佳工藝條件：提取時(shí)間為10.5 min，料液比為1∶40.8，pH為13.4，在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，最終得率為5.45%。

2.4 百里香多糖抗氧化作用的結(jié)果與分析

2.4.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

圖6 百里香多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of thyme polysaccharides on DPPH free radicals

由圖6可知，隨著百里香多糖濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率不斷提高，當(dāng)百里香多糖的濃度為1.2 mg/mL時(shí)達(dá)到了最高值58%，但是與Vc的DPPH清除能力比較略低。

2.4.2 百里香多糖對(duì)OH自由基的清除作用

圖7 百里香多糖對(duì)OH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of thyme polysaccharides on OH free radicals

由圖7可知，隨著百里香多糖濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除能力穩(wěn)定增強(qiáng)，當(dāng)百里香多糖濃度超過(guò)8.0 mg/mL后，對(duì)羥基自由基的清除能力趨于穩(wěn)定。百里香多糖的濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率最高，為39.74%。相比等量Vc的OH自由基清除能力，比百里香多糖對(duì)羥基自由基的清除能力高。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助堿水提取百里香多糖過(guò)程中，pH對(duì)百里香多糖提取率的影響效果最為顯著，然后依次為提取時(shí)間、料液比。響應(yīng)面優(yōu)化得知百里香多糖最佳的提取工藝條件：提取時(shí)間為10.5 min，料液比為1∶40.8，pH為13.4，百里香多糖的提取率為5.45%；抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明百里香多糖具有一定的抗氧化活性，試驗(yàn)結(jié)果表明，百里香多糖的濃度為1.2 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為58%；百里香多糖的濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)OH自由基的清除率為39.74%，但與等濃度Vc相比抗氧化作用略低，有待進(jìn)一步研究。