張晶，葉碧霞，左勇*，謝光杰，張鑫，孫時光

(1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646000)

甜面醬是以面粉為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的半固態(tài)調(diào)味品，其味甜咸適宜，鮮味濃郁，深受廣大消費者喜愛[1]。甜面醬的生產(chǎn)可概括為前期制曲、中期拌鹽水以及后期發(fā)酵[2]。傳統(tǒng)的自然曬露發(fā)酵方式生產(chǎn)的甜面醬，其成品顏色鮮艷，口感細膩，酯香濃郁，但由于生化反應(yīng)緩慢，發(fā)酵周期較長，需12個月左右才能使面醬成熟，從而影響企業(yè)產(chǎn)能的進一步提升。研究表明：可對傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式進行改進[3，4]，通過添加酶制劑及人工保溫發(fā)酵，能夠縮短生產(chǎn)周期，但其成品質(zhì)量不及傳統(tǒng)自然曬露方式所生產(chǎn)的甜面醬[5]。據(jù)報道[6，7]，基于傳統(tǒng)自然曬露以及人工保溫發(fā)酵兩種方式提出的先保溫后曬露的生產(chǎn)方式用于生產(chǎn)甜面醬，在縮短生產(chǎn)周期的同時，可彌補人工保溫所造成的品質(zhì)不足的缺陷，因而具有應(yīng)用前景。

目前，對于先保溫后曬露發(fā)酵方式的研究處于起步階段，其工藝有待進一步探究。通過對甜面醬在保溫發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成時期研究表明，發(fā)酵后期為甜面醬保溫發(fā)酵中主體風(fēng)味物質(zhì)的形成時期[8]。本研究將通過對不同發(fā)酵時間段的醬醪進行理化分析，初步探究大分子物質(zhì)快速降解的階段，并以其作為分段依據(jù)，為兩段式發(fā)酵技術(shù)中最佳保溫發(fā)酵時間的確定提供理化指標(biāo)等參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

人工保溫發(fā)酵的甜面醬樣品，發(fā)酵時間以拌鹽水入池為0天計算。人工保溫發(fā)酵周期通常是60天，拌鹽水后每隔1周需進行倒醅，以達到大分子物質(zhì)的充分降解。結(jié)合類似研究，故取樣時間設(shè)置為0，5，10，15，20，25，30，35，40，47，54，60天。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pH酸度計 奧豪斯儀器(上海)有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 試驗方法

2.1 理化指標(biāo)測定

含水量的測定：采用快速水分含量測定儀；總酸及氨基酸態(tài)氮的測定：采用直接滴定法以及甲醛滴定法；還原糖含量的測定：采用斐林法[9]。

2.2 酶活力測定

淀粉酶活力的測定：采用碘量法；中性蛋白酶以及酸性蛋白酶活力的測定：依據(jù)國標(biāo)法[10]。

2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進行分析，采用Duncans新復(fù)極差法進行多重比較[11]。在0.05水平上檢驗試驗結(jié)果差異顯著性，試驗結(jié)果采用Origin作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 甜面醬保溫發(fā)酵過程中含水量的變化情況

保溫發(fā)酵過程中，水分含量直接影響微生物的生長代謝，同時也影響各種酶活力的大小，監(jiān)測含水量的變化情況能夠?qū)崟r反映發(fā)酵是否正常。水分含量的變化情況見圖1。

圖1 保溫發(fā)酵過程中含水量的變化Fig.1 Changes of moisture content at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同字母表示含水量存在顯著性差異(P<0.05)。

由圖1可知，隨著保溫發(fā)酵時間的延長，醬醪中水分含量逐漸降低。含水量從最初的43.9%降低至成熟時的38.96%。造成含水量下降的原因有：其一，保溫發(fā)酵溫度通?？刂圃?8～45 ℃以實現(xiàn)大分子物質(zhì)的快速降解，高溫使得水分蒸發(fā)；其二，發(fā)酵過程中微生物的生長代謝及相關(guān)化學(xué)反應(yīng)會消耗一定的水分。

3.2 甜面醬保溫發(fā)酵過程中總酸與pH的變化情況

由于酸度直接影響酶活力，也會影響微生物的生長分布情況，從而影響物質(zhì)的代謝以及轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)上常會通過監(jiān)測發(fā)酵醬醪的酸度變化情況來調(diào)整溫度。甜面醬保溫發(fā)酵過程中總酸以及pH值的變化情況見圖2。

圖2 保溫發(fā)酵過程中總酸和pH的變化Fig.2 Changes of total acid and pH values at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同小寫字母表示總酸含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示pH值差異顯著(P<0.05)。

由圖2可知，醬醪中總酸含量隨著發(fā)酵的進行逐漸上升，pH值則反之。保溫發(fā)酵0～20天，醬醪酸度快速上升，從0.67%上升到1.42%；同時，醬醪pH值則由5.7降低到4.9。發(fā)酵過程中，酸度的變化一方面源自于微生物發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸，另一方面則是由原料中蛋白質(zhì)降解生成的游離氨基酸帶來[12]。研究表明[13]：醬類發(fā)酵過程中，酸度的變化與乳酸菌的作用密切相關(guān)，發(fā)酵初期，乳酸菌快速繁殖同時大量產(chǎn)酸。保溫20～35天左右時，醬醪中的總酸含量約為1.48%(P>0.05)，醬醪pH值由4.9下降到4.33。保溫發(fā)酵35～60天，甜面醬中酸度變化幅度減緩，從1.48%上升到1.8%，增加了0.32%，較之于保溫前期酸度增加趨勢減慢，醬醪pH值由4.33下降到3.82。其原因可能是酸度的積累一定程度上會抑制產(chǎn)酸細菌的增長，從而反饋調(diào)節(jié)酸度的增加，部分酸作為中間代謝物質(zhì)參與到其他化學(xué)反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為其他的物質(zhì)，從而使得酸度增加趨勢減緩。

3.3 甜面醬保溫發(fā)酵過程中還原糖含量與淀粉酶活力的變化情況

甜面醬中還原糖主要來源于原料中淀粉等大分子物質(zhì)在淀粉酶等作用下水解生成糊精、麥芽糖以及葡萄糖等小分子物質(zhì)，進而參與到酒精及乳酸發(fā)酵等多種化學(xué)反應(yīng)中。還原糖的含量可在一定程度上反映原料中糖類物質(zhì)的降解程度，還原糖含量與淀粉酶活力變化見圖3。

圖3 保溫發(fā)酵過程中還原糖含量與淀粉酶活力的變化Fig.3 Changes of reducing sugar content and amylase activity at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同小寫字母表示還原糖含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示淀粉酶活力差異顯著(P<0.05)。

由圖3可知，保溫發(fā)酵過程中，甜面醬中還原糖含量隨著保溫時間的延長而逐漸上升直至穩(wěn)定，而淀粉酶的活力則逐漸下降。保溫發(fā)酵0～20天，還原糖含量由18.75%增加到25.65%，增幅達6.95%，該階段還原糖含量顯著增加(P<0.05)，淀粉酶活力從最初的158.99 U/g干基下降到61.29 U/g干基?？赡茉蛟谟冢喊棼}水初期，相對大的鹽含量及曲料拌和不均帶來的氧氣傳遞受阻等使得制曲階段所富集的霉菌在此階段生長代謝受阻出現(xiàn)大量消亡，但其所分泌的糖化酶適于在中性及偏酸性的環(huán)境中發(fā)揮作用，pH值的適當(dāng)降低對糖化酶活影響不大，因此發(fā)酵前期糖化酶類繼續(xù)發(fā)揮作用，快速催化淀粉等多糖類物質(zhì)水解為小分子類還原糖，從而使得還原糖含量快速增加。保溫發(fā)酵20～40天，還原糖含量上升至27.3%，此階段增幅約為1.65%；保溫發(fā)酵40～60天，甜面醬中還原糖含量基本維持穩(wěn)定，約為27.3%(P>0.05)。結(jié)合數(shù)據(jù)分析可知，20天后，其含量增幅減小，原因可能在于：隨著發(fā)酵的進行，原料中淀粉類物質(zhì)降解仍繼續(xù)，但水解生成的還原糖部分充當(dāng)碳源供微生物生長代謝，同時部分還充當(dāng)?shù)孜飬⑴c到酒精、乳酸等發(fā)酵賦予甜面醬甜味，以及參與醬醪色素成分如氨基糖、焦糖等的合成，從而導(dǎo)致還原糖含量上升緩慢。

整個保溫發(fā)酵過程中還原糖含量以及淀粉酶活力的變化情況表明，保溫發(fā)酵0～20天，此階段可以視為甜面醬中淀粉等大分子物質(zhì)快速降解的時期，此后還原糖含量雖然也有增加，但上升趨勢減緩，該研究結(jié)果與張靜等[14]的研究結(jié)果相一致。從淀粉類降解情況而言，保溫發(fā)酵20～40天，此階段甜面醬中的淀粉類大分子糖類物質(zhì)已經(jīng)最大程度地降解為還原糖類小分子，40天后隨著保溫發(fā)酵繼續(xù)進行，其含量不再顯著性增加。綜上，保溫發(fā)酵20～40天后則可以終止保溫發(fā)酵階段，進入曬露發(fā)酵階段。

3.4 甜面醬保溫發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量與蛋白酶活力的變化情況

添加鹽水進行保溫發(fā)酵，此階段醬醪環(huán)境呈酸性(pH 4～5)，故保溫階段中主要考慮中性蛋白酶以及酸性蛋白酶的活力。氨基酸態(tài)氮主要源自于蛋白酶水解蛋白質(zhì)生成，其含量可反映蛋白質(zhì)的水解程度[15]。甜面醬保溫發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮與蛋白酶活力變化情況見圖4。

圖4 保溫發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮與蛋白酶活力的變化Fig.4 Changes of amino nitrogen content and protease activity at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同小寫字母表示氨基酸態(tài)氮含量存在顯著性差異(P<0.05)；不同大寫字母表示酸性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)；不同希臘字母表示中性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)。

由圖4可知，隨著發(fā)酵的進行，氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升，而兩種蛋白酶活力均快速降低。由于醬醪環(huán)境偏酸性，此條件下酸性蛋白酶活力高于中性蛋白酶活力。保溫發(fā)酵0～20天，醬醪中的氨基酸態(tài)氮含量從0.22%上升到0.37%，增加了0.15%，該階段氨基酸態(tài)氮含量顯著變化(P<0.05)。原因可能是制曲階段霉菌所分泌的蛋白酶在發(fā)酵前期起到水解蛋白的作用，中性蛋白酶將原料中的蛋白質(zhì)分解為不同大小的肽類，酸性蛋白酶作為一類肽酶則可進一步將肽類降解為游離氨基酸[16]，從而使得前期氨基酸態(tài)氮的含量快速積累。保溫發(fā)酵20～40天，其含量從0.37%緩慢上升為0.39%，增幅較小，約為0.02%；保溫發(fā)酵40～60天，其含量則略有降低。通過多重比較分析各時期甜面醬中氨基酸態(tài)氮含量差異性可知，其含量在發(fā)酵前期及中期存在顯著性差異，發(fā)酵后期略有下降但基本維持穩(wěn)定?？赡茉蛟谟冢喊l(fā)酵后期水分含量減少，高鹽以及偏酸的發(fā)酵環(huán)境使得蛋白酶的活力降低，同時一部分氨基酸經(jīng)脫羧、脫氨基后參與其他化合物的合成相關(guān)反應(yīng)中，消耗掉醬醪中的部分氨基酸，故導(dǎo)致其含量增幅較小。

從保溫發(fā)酵整個過程來看，保溫發(fā)酵0～20天，氨基酸態(tài)氮含量變化較大(P<0.05)，該階段為原料中蛋白質(zhì)的快速降解階段，隨著保溫進行，氨基酸態(tài)氮含量亦有增加，但增加趨勢減緩。20～40天甜面醬中的蛋白質(zhì)最大程度地得到降解。發(fā)酵40天后，氨基酸態(tài)氮含量基本保持不變。結(jié)合保溫成本考慮，保溫發(fā)酵20～40天后則可以終止保溫發(fā)酵階段，進入曬露發(fā)酵階段。

3.5 甜面醬保溫發(fā)酵過程中醬體感官變化情況

甜面醬發(fā)酵過程中，甜面醬的外觀形態(tài)變化一定程度上反映發(fā)酵進行的程度。甜面醬保溫過程中感官變化情況見表1。

表1 保溫發(fā)酵過程中甜面醬的感官記錄Table 1 Sensory analysis records of sweet flour paste at different insulation fermentation time

由表1可知，醬體顏色與發(fā)酵時間呈正相關(guān)性；香氣則從發(fā)酵初期無明顯的香氣到后期醬香、酯香味突出；醬醪滋味隨著發(fā)酵進行，甜、鮮味愈來愈強，咸味則是從拌入鹽水后就一直存在；醬醪體態(tài)在拌鹽水初期，存在較大面疙瘩，隨著發(fā)酵進行，面團逐漸減小，分散的小面團使得醬醪整體呈現(xiàn)為較濃稠的狀態(tài)；發(fā)酵中后期，醬體出現(xiàn)大量氣孔分布；發(fā)酵終止時，氣孔消失，粘稠度適中。

甜面醬的感官形態(tài)變化與甜面醬發(fā)酵過程中的機理變化密切相關(guān)[17]。醬體顏色形成的可能原因有：葡萄糖α-羥基與氨基酸置換生成氨基糖，氨基糖作為醬體中色素組成，通常呈現(xiàn)棕紅色；同時，葡萄糖在高溫下脫水會形成焦糖，焦糖作為無定形的膠體物質(zhì)，呈棕紅色；原料分解的酪氨酸經(jīng)氧化作用生成黑色素，氨基酸與還原糖經(jīng)美拉德反應(yīng)生成類黑素；多酚類物質(zhì)在多酚氧化酶作用下也會生成黑色素。醬體的香氣主要得益于揮發(fā)性物質(zhì)的生成，通常為醇、醛、酸、酚類等物質(zhì)；各種醇類物質(zhì)又與醬中有機酸經(jīng)酯化反應(yīng)生成各種乙酯，酯類物質(zhì)通常具有芳香，為香氣來源之一[18]。咸味由拌入的食鹽水帶來，存在于整個發(fā)酵階段。甜、鮮味隨著發(fā)酵進行而逐漸顯現(xiàn)，可能原因在于：原料中淀粉類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖等，該類小分子還原糖產(chǎn)生明顯甜味，原料中蛋白質(zhì)經(jīng)曲霉蛋白酶降解為部分氨基酸呈現(xiàn)適度甜味；甜面醬的鮮味主要來源于小分子肽、核苷酸以及呈鮮味的氨基酸等[19]。隨著甜面醬趨于成熟，甜面醬滋味愈發(fā)爽口柔和，可能原因有：醬醪發(fā)酵過程中酒精發(fā)酵產(chǎn)生副產(chǎn)物甘油、高級醇等，此類物質(zhì)具有一定的呈味作用，同時作為酯化反應(yīng)的基礎(chǔ)物質(zhì)，使得醬體滋味爽口柔和[20]。在不同的發(fā)酵階段，甜面醬呈現(xiàn)不同的醬體狀態(tài)，發(fā)酵初期甜面醬由于制曲結(jié)束，面糕上分布有米曲霉等霉菌菌絲，部分結(jié)塊，經(jīng)拌鹽水入池后，有大塊團狀的面糕分布在醬體中。隨著發(fā)酵進行，原料中大分子物質(zhì)降解，大塊面團逐漸呈小塊狀分布，此時醬醪略微干稠。發(fā)酵中期微生物產(chǎn)酸產(chǎn)氣作用明顯，使得醬醪中出現(xiàn)很多氣孔，到后期微生物出現(xiàn)消長變化，發(fā)酵趨于結(jié)束時，醬體中氣孔消失，甜面醬均勻無雜質(zhì)。

4 結(jié)論

通過對甜面醬保溫發(fā)酵過程中反映發(fā)酵狀況的相應(yīng)指標(biāo)分析研究，所得如下結(jié)論：

甜面醬保溫發(fā)酵過程中含水量從最初的43.9%降低至成熟時的38.96%；總酸含量由0.67%增加至結(jié)束時的1.8%。保溫發(fā)酵0～20天，醬醪中還原糖與氨基酸態(tài)氮含量快速增加，分別由18.75%，0.22%上升到25.65%，0.37%；20～40天，兩種物質(zhì)含量增加趨勢變緩，分別由25.65%，0.37%上升為27.3%，0.39%；40天之后，兩種物質(zhì)含量則基本維持穩(wěn)定。保溫發(fā)酵20～40天，此階段原料中淀粉及蛋白質(zhì)類大分子物質(zhì)得到最大程度的降解，此時的感官變化情況表明甜面醬尚未完全成熟，還需繼續(xù)發(fā)酵。因此，保溫發(fā)酵40天可達到保溫發(fā)酵快速降解原料中淀粉及蛋白質(zhì)類大分子物質(zhì)的目的。

通過對甜面醬保溫發(fā)酵過程中發(fā)酵機理的研究，可初步確定保溫發(fā)酵40天為保溫發(fā)酵階段結(jié)束的適宜階段，此時結(jié)束保溫發(fā)酵可進入下一曬露發(fā)酵階段繼續(xù)發(fā)酵。但是，因確定的適宜的保溫發(fā)酵時間階段跨度較大，還需進一步研究以明確保溫發(fā)酵終止的最佳時間。

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