楊志鵬，王婷，袁峰，阮文婷，劉新利*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353；2.江蘇神華藥業(yè)有限公司，江蘇 金湖 211600)

海棠果(CalophylluminophyllumL.)，即海棠樹的果實，原產(chǎn)于我國，現(xiàn)主要分布在華北地區(qū)，其果皮色澤鮮紅奪目，果肉黃白色，鮮食酸甜香脆[1]。海棠果中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、多種維生素、有機酸等，能夠補充人體所需的營養(yǎng)，增強對疾病的抵抗力，具有生津止渴、健脾開胃、澀腸止痢的功效。酵素是指以動物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品，其包含天然營養(yǎng)物質(zhì)、酶、有益微生物及其活性代謝物。針對不同人群，酵素產(chǎn)品的原料配伍及工藝側(cè)重點有所不同，酵素產(chǎn)品一是注重有針對性的營養(yǎng)補充，二是注重有針對性的營養(yǎng)均衡。酵素產(chǎn)品市場火熱，也體現(xiàn)了大眾認(rèn)識到合理飲食對健康的重要性，防病于未然[2]。

海棠果酵素在國內(nèi)外研究少見報道，該酵素以海棠果為主要原料，打漿機打漿后接入益生菌進(jìn)行發(fā)酵，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，得到既富含多種營養(yǎng)成分，又包含活性益生菌及有益代謝產(chǎn)物的優(yōu)質(zhì)酵素產(chǎn)品。因此通過本項目開發(fā)海棠果酵素，并研究其活性物質(zhì)、營養(yǎng)成分及功效評價，對于豐富酵素產(chǎn)品種類及其他酵素產(chǎn)品的開發(fā)具有指導(dǎo)意義。海棠果酵素采用鼠李糖乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，待發(fā)酵完成后對海棠果酵素中的總糖、氨基酸、多酚、膽固醇去除率以及抗氧化性進(jìn)行了研究，提供了較為詳實的數(shù)據(jù)資料，開發(fā)的海棠果酵素對人體調(diào)節(jié)腸道平衡、清除膽固醇和延緩衰老具有重要作用。

1 材料與設(shè)備

1.1 菌株

發(fā)酵實驗所用到的鼠李糖乳桿菌217-3為我實驗室保藏菌株[3]。

1.2 設(shè)備

FE20型pH計、RS232-C型分光光度計、5417R型離心機、DJ1-0.12型打漿機、LDZX-50KB型滅菌鍋、L-8900型氨基酸分析儀、SHP-150型恒溫培養(yǎng)箱、UB-7型酸度計。

1.3 試劑和材料

1.3.1 乳酸菌培養(yǎng)基(MRS)

1 L配方為蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸三銨2 g，七水硫酸鎂0.58 g，乙酸鈉3.12 g，磷酸氫二鈉1.63 g，乙酸鉀2.25 g，吐溫80 1 mL，四水硫酸錳0.25 g；膽固醇培養(yǎng)基；MRS-STC-CHOL培養(yǎng)基。

1.3.2 氯化鈉溶液

0.85 g NaCl溶解于100 mL雙蒸水中，滅菌后使用。

1.3.3 試劑

苯酚、濃硫酸、無水乙醇、葡萄糖、茚三酮、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、沒食子酸、碳酸鈉、福林酚試劑等：均為分析純；DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)：Sigma 公司；乳清蛋白粉：藍(lán)宇科貿(mào)有限公司。

2 試驗方法

2.1 海棠果酵素的生產(chǎn)流程

選取新鮮海棠果→去核→打漿→果汁過濾→添加C，N源→調(diào)節(jié)pH值→滅菌→接入益生菌→發(fā)酵→檢測pH值→后熟→成分檢測→口感調(diào)節(jié)。

2.2 海棠果酵素發(fā)酵時間的測定

由于乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為24 h左右，所以在海棠果酵素發(fā)酵24 h后，于超凈工作臺中每隔1 h取5 mL海棠果酵素用酸度計測其pH值。因為乳酸菌經(jīng)過發(fā)酵后會產(chǎn)生乳酸，使得酵素pH下降，當(dāng)海棠果酵素中的pH穩(wěn)定后，海棠果酵素即發(fā)酵完成，隨后逐漸進(jìn)入后熟階段。

2.3 海棠果酵素總糖含量的檢測

采用苯酚-硫酸法測定酵素中總糖的含量[4]。

分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液置于試管中，用蒸餾水補至1.0 mL。向試管中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，后快速加入5.0 mL硫酸，靜置10 min。使用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，后將試管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，490 nm處測吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后取酵素樣品，稀釋至適宜濃度，用移液槍吸取適宜體積于試管中，重復(fù)上述操作，測定酵素稀釋液的吸光度。

2.4 海棠果酵素氨基酸含量的檢測

先采用茚三酮粗測氨基酸含量，然后使用氨基酸分析儀進(jìn)樣檢測[5]。

準(zhǔn)確吸取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL，分別置于25 mL的容量瓶或比色管中，各加水補充至容積為4.0 mL，然后加入茚三酮溶液和磷酸鹽緩沖溶液各1 mL，混合搖勻，于水浴上加熱15 min，取出迅速冷卻至室溫，加水至標(biāo)線(25 mL)，搖勻。靜置15 min后，在570 nm波長下，以空白試劑為參比液測定其余各溶液的吸光度。以氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。后吸取澄清的樣品溶液1～4 mL，置于25 mL的容量瓶或比色管中，重復(fù)上述操作，測其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測出的樣品吸光度，計算出氨基酸含量，稀釋適宜倍數(shù)后用氨基酸分析儀進(jìn)行檢測。

2.5 海棠果酵素多酚含量的檢測

用移液管分別移取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度線，濃度分別為10,20,30,40,50 μg/mL。量取沒食子酸工作液和蒸餾水各1 mL于試管內(nèi)，再分別加入5.0 mL的10%福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)3～8 min內(nèi)，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻，室溫下放置60 min，用10 mm比色皿在765 nm波長下測吸光值[6]。以沒食子酸的微克數(shù)為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。量取1 mL待測液，重復(fù)上述操作，測其吸光度。

2.6 海棠果酵素膽固醇脫除能力的研究

血清中高膽固醇含量被認(rèn)為是誘發(fā)高血壓、冠心病等眾多心血管疾病的重要因素。國內(nèi)外大量臨床實驗證實，服用乳酸菌及其相關(guān)制品具有減少人體血清膽固醇含量、降低心血管疾病發(fā)病率的功效[7]。通過對實驗室保藏的多種乳酸菌的膽固醇脫除率進(jìn)行比較后，選擇膽固醇脫除率最高的鼠李糖乳桿菌217-3為出發(fā)菌株，同時對開發(fā)的海棠果酵素的膽固醇脫除能力進(jìn)行檢測。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將膽固醇工作液分別配制成不同濃度的膽固醇溶液(30,35,40,45,50,55 mg/L)，于550 nm下測定吸光值并繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照同樣方法測定MRS-STC-CHOL培養(yǎng)基中的初始膽固醇含量。將富含活性鼠李糖乳桿菌的海棠果酵素以10%接種于MRS-STC-CHOL培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵24 h。測定培養(yǎng)上清液中膽固醇含量, 計算膽固醇去除率。膽固醇去除率按下式計算：

去除率=(初始膽固醇含量-上清液膽固醇含量)/初始膽固醇含量×100%。

2.7 海棠果酵素抗氧化性的研究

海棠果中富含多酚類物質(zhì)和原花青素等黃酮類物質(zhì)，是天然的抗氧化劑，對清除人體內(nèi)自由基、抗衰老等方面具有極大的作用。加之采用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，提高了體內(nèi)抗氧化物質(zhì)活性，從而有效清除人體內(nèi)的自由基。海棠果抗氧化性的研究采用DPPH抗氧化實驗。二苯基苦基苯肼(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，DPPH·)是一種穩(wěn)定的有機自由基，當(dāng)樣品中存在自由基清除物質(zhì)時，會與自由基的單電子配對而使其吸收逐漸消褪，用分光光度法通過吸收值的變化可計算出樣品清除自由基的活性，從而評價海棠果酵素的抗氧化活性[8]。

用100 μL一定濃度梯度的樣品加入到試管中，然后向每管中加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，混勻避光37 ℃水浴1 h后在517 nm下測定吸光度值，以乙醇做空白對照，每個樣品均平行測定3次，結(jié)果以SC50值表示。DPPH自由基清除率為50%時所需樣品的濃度為SC50，DPPH自由基清除率按下式計算：

清除率(%)=[1-(As/Ac )]×100%。

式中: Ac為空白對照管的吸光度值；As為樣品測定管的吸光度值。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)酵菌種的選擇

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)是一種常見的益生菌，在人體新陳代謝中起著關(guān)鍵作用。該菌屬于乳桿菌(Lactobacillus)屬、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)種，革蘭氏陽性菌，無質(zhì)粒，由于其糖代謝時可代謝單糖而不可代謝乳糖而得名。鼠李糖乳桿菌腸道黏著率高，定植能力強，并具有高效降膽固醇、促進(jìn)細(xì)胞分裂的能力，可起到調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉、排除毒素、預(yù)防齲齒、提高機體免疫力及抗癌等重要生理保健功能，可廣泛應(yīng)用于青貯飼料、功能食品和醫(yī)療保健等領(lǐng)域[9]。

3.2 海棠果酵素發(fā)酵時間的確定

自接入益生菌菌株后，每隔4 h對海棠果酵素的pH值和活菌數(shù)進(jìn)行檢測，在56 h內(nèi)海棠果酵素的pH值和活菌數(shù)變化曲線見圖1。

圖1 56 h內(nèi)海棠果酵素pH值和活菌數(shù)變化曲線

由圖1可知，海棠果酵素在前4 h內(nèi)，pH值只是略微下降，這是由于接入的益生菌仍處于延滯期，生長緩慢。進(jìn)入對數(shù)期后，pH值呈快速下降的趨勢，4～24 h，pH值從6.32迅速下降至3.43。這階段pH值的快速下降主要歸結(jié)于鼠李糖乳桿菌的快速增殖需要消耗糖代謝提供的能量，由此生成乳酸速度加快。隨著乳酸的不斷生成，海棠果果汁的緩沖能力不斷增強以及鼠李糖乳桿菌的生長代謝受到抑制，進(jìn)入穩(wěn)定期后pH的變化不再明顯，直至48 h左右，pH值基本不再發(fā)生變化，穩(wěn)定在3.02左右。由活菌數(shù)曲線可以看出，開始發(fā)酵的4 h內(nèi)，酵素中的活菌數(shù)并無明顯變化。4 h之后，鼠李糖乳桿菌進(jìn)入指數(shù)期，活菌數(shù)迅速升高，并于24 h左右趨于穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定期，基本符合其pH值的變化。由此判定該海棠果酵素的發(fā)酵時間為48 h。

3.3 海棠果酵素總糖含量的檢測結(jié)果

葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

海棠果酵素的10倍稀釋樣品在490 nm處的吸光度為0.217，由圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，海棠果酵素的總糖含量為175 mg/L。

3.4 海棠果酵素氨基酸含量的檢測結(jié)果

氨基酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 氨基酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

海棠果酵素的100倍稀釋樣品在570 nm處的吸光值為0.163，由圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，海棠果酵素的氨基酸含量大致為1.422×103mg/L。在使用氨基酸分析儀檢測后，經(jīng)數(shù)據(jù)分析得出海棠果酵素中的氨基酸總量為1.83×103mg/L，可以檢測到16種氨基酸，含量最高的為脯氨酸，為0.52×103mg/L，排在前4位的氨基酸分別為脯氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和纈氨酸，酵素中必需氨基酸的含量/氨基酸總含量為0.409，達(dá)到了聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)提出的蛋白質(zhì)中必需氨基酸與總氨基酸的比值應(yīng)在0.40以上的參考蛋白模式[10]。

3.5 海棠果酵素多酚含量的檢測結(jié)果

多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

海棠果酵素的20倍稀釋樣品液在765 nm處的吸光度為0.3452，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，該海棠果酵素的多酚含量為5.73×102mg/L。

3.6 海棠果酵素去除膽固醇能力的檢測結(jié)果

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖5 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

海棠果酵素膽固醇去除率見表1。

表1 海棠果酵素膽固酵去除率

通過結(jié)果分析得出MRS-STC-CHOL培養(yǎng)基中初始膽固醇含量為200 mg/L，上清液的膽固醇含量的53.3 mg/L，因此海棠果酵素的膽固醇降解率為73.4%。對清除人體內(nèi)膽固醇具有顯著效果。

3.7 海棠果酵素清除自由基能力的檢測結(jié)果

采用DPPH抗氧化實驗計算出海棠果酵素的自由基清除能力，清除率曲線見圖6。

圖6 海棠果酵素清除率曲線

根據(jù)曲線可以得出海棠果酵素的自由基清除率較高，具有較高的抗氧化活性，其SC50值為0.0715。

4 總結(jié)

本文以開發(fā)具有高生物活性的海棠果酵素產(chǎn)品為研究目的，通過優(yōu)選活性益生菌菌株，跟蹤檢測發(fā)酵過程pH值、活菌數(shù)、總糖、氨基酸和多酚含量，確定了海棠果酵素的發(fā)酵時間，并通過海棠果酵素的膽固醇脫除能力，對海棠果酵素的體外益生功能做了評價。該產(chǎn)品具有潛在的調(diào)節(jié)人體內(nèi)腸道平衡，提高機體抗氧化能力和免疫水平，幫助營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，延緩衰老，促進(jìn)身心健康的功效，酸甜可口，適于多種人群的合理膳食。

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