李偌銥 王 嫄 林 凱 朱美財(cái)

(中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京 100142)

細(xì)胞凋亡參與癌癥的全過(guò)程，并對(duì)癌癥的發(fā)生起負(fù)調(diào)控作用〔1，2〕。氧化應(yīng)激反應(yīng)可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，并參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展〔3～5〕。Ca2+作為許多癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)載體，對(duì)細(xì)胞的生存與凋亡有著重要的作用〔6〕。凋亡是由十分復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路所調(diào)控，目前已知的信號(hào)傳導(dǎo)通路有線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。Ca2+通過(guò)肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP 酶(SERCA)從胞質(zhì)中攝入，通過(guò)肌醇-1，4，5- 三磷酸受體(InsP3R)/Ca2+通道或RyR/Ca2+通道釋放，可見(jiàn)這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路都與Ca2+有密切關(guān)系〔7〕，但關(guān)于Ca2+如何激活凋亡調(diào)節(jié)因子的分子機(jī)制目前尚未闡明。本研究主要探討氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 NCIH446細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；過(guò)氧化氫(H2O2)購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自Life technology公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自Qiagen公司；PCR酶購(gòu)自BIO-RAD公司；Counting cell Ⅱ (Thermo Fisher)；載玻片和蓋玻片購(gòu)自日本公司；DPBS緩沖液、培養(yǎng)基1640胎牛血清購(gòu)自GIBCO；雙抗購(gòu)自Life technology；Flu4購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) NCIH446細(xì)胞培養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室，置于37℃,5%CO2,20%O2的CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)，1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+500 μl/L雙抗。

1.3處理方法 5×105的NCIH446細(xì)胞種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后，加入2、20、200 μmol/L H2O2處理4 h，以H2O2誘導(dǎo)NCIH446細(xì)胞，建立體外氧化應(yīng)激損傷模型，以空白作為對(duì)照。

1.4細(xì)胞凋亡分析 取氧化應(yīng)激處理細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞各10 μl，加入10 μl臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混合，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，檢測(cè)總細(xì)胞數(shù)量和死細(xì)胞的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。細(xì)胞凋亡率=死細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察 取氧化應(yīng)激處理組和對(duì)照細(xì)胞，在Nikon倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化及細(xì)胞核的變化，放大40倍，同時(shí)用顯微鏡圖像采集系統(tǒng)采集圖像。

1.6激光共聚焦分析 以DPBS緩沖液清洗各處理細(xì)胞3次，F(xiàn)lu4終濃度為4 μmol/L，避光，37℃恒溫輕輕振蕩，孵育45 min，負(fù)載后的細(xì)胞以含0.2%牛血清白蛋白的DPBS緩沖液清洗2次，DPBS緩沖液清洗1次，以充分洗去細(xì)胞外未負(fù)載的殘余熒光染料；按上所述，向各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中加入相應(yīng)的孵育緩沖液，室溫放置20 min，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)作相應(yīng)檢測(cè)。以488 nm波長(zhǎng)的激光作激發(fā)光在515 nm處探測(cè)熒光發(fā)射,選擇形態(tài)佳、貼壁好、在3～5 min保持熒光值穩(wěn)定的細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè),選取15個(gè)細(xì)胞為1組，共選取3組，上述以測(cè)得熒光絕對(duì)強(qiáng)度代表Ca2+相對(duì)強(qiáng)度。每隔20 s掃描1次,直接監(jiān)測(cè)單個(gè)NCIH446胞內(nèi)游離Ca2+濃度。以Ziss LSM 710激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行成像，以ZEN 2011圖像處理軟件分析Ca2+的濃度。

1.7實(shí)時(shí)定量PCR 分析

1.7.1總RNA提取和cDNA的合成 收集處理后5×106的NCIH446細(xì)胞樣品，根據(jù)Qiagen試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用Qubit3定量總RNA，根據(jù)BIO-RAD試劑盒按步驟合成cDNA，合成cDNA的實(shí)驗(yàn)條件為95℃ 10 min，60℃ 30 s，95℃ 60 s。

1.7.2mRNA引物的設(shè)計(jì)和合成 引物合成由中美泰和有限公司合成，引物序列：CACNA2D1正義：5′-ACTCCATATTCCCACCGACAT-3′，反義：5′-GCCAAAC ACCTGCCACAA-3′,長(zhǎng)度133 bp;PI3K正義：5′-TTGCT GTTCGGTGCTTGG-3′,反義：5′-GACTTGCCTATTCAGG TGCTTC-3′,長(zhǎng)度278 bp;PKC正義:5′-CGCTTCGCCCGCAAAGG-3′，反義:5′-GCAGGTGTCACATTTCATCCC-3′,長(zhǎng)度351 bp;Bcl-2:正義:5′- TGTGTGTGGA GA GCGTCAAC-3′,反義:5′- GCCAGAGAAATCAAACAG AGG-3′,長(zhǎng)度173 bp;ALK正義:5′-ACTCTCGCTGATCCTCTCTG-3′,反義:5′-TTGCTCAGCTTGTACTCAGG-3′,長(zhǎng)度150 bp;KRAS正義:5′-GGAAGCAAGTAGTAATTGATGGA-3′,反義:5′-TTTATGGCAAATACACAAA GAAAG-3′，長(zhǎng)度133 bp;BAX正義:5′-CTGACGGCAA CTTCAACTGG-3′,反義:5′-GTGAGGAGGCTTGAGGAG TC-3′,長(zhǎng)度197 bp;β-actin正義：5′-CTTTGATTGCACATTGTTGT-3′,反義：5′-GAAGCAATGCTATCACCTC-3′,長(zhǎng)度153 bp。

1.7.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX connect 96實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)引物設(shè)6個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)體系為20 μl，包括上下游引物各1 μl，混合緩沖液5 μl,模板cDNA 1 μl，DDH2O 10 μl,反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)，數(shù)據(jù)采用CFX Manger 2.1進(jìn)行分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肺癌細(xì)胞凋亡的變化 隨著外源性H2O2濃度的加大，細(xì)胞凋亡增多；20 μmol/L組(14.89%±6.34%)、200 μmol/L組(39.70%±12.30%)，與對(duì)照組(4.80%±2.62%)凋亡率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但2 μmol/L組(5.40%±3.12%)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2肺癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化 肺癌細(xì)胞經(jīng)200 μmol/L H2O2氧化應(yīng)激處理4 h，細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，細(xì)胞出現(xiàn)接觸分離現(xiàn)象，細(xì)胞核出現(xiàn)部分小的碎片，而對(duì)照組細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核形態(tài)正常，見(jiàn)圖1。

圖1 氧化應(yīng)激對(duì)肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響(×40)

2.3肺癌細(xì)胞中Ca2+濃度的變化 200 μmol/L組細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度(202.18±21.20)明顯高于對(duì)照組(32.20±18.02，P<0.05)。

2.4肺癌細(xì)胞中Ca2+相關(guān)因子mRNA水平的變化 200 μmol/L組PKC基因mRNA水平(1.90±0.32)、PI3K基因mRNA水平(1.70±0.26)、CACNA2D1基因mRNA水平(1.93±0.30)均顯著高于對(duì)照組(1.00)(P<0.05)。

2.5肺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA水平的變化 200 μmol/L組ALK基因mRNA水平(2.01±0.22)、KARS基因mRNA水平(1.50±0.16)、BAX基因mRNA水平(2.61±0.40)、Bcl-2基因mRNA水平(0.60±0.13)與對(duì)照組(1.00)差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

在腫瘤細(xì)胞，活性氧(ROS)的來(lái)源可能是線粒體電子傳遞鏈，一氧化氮合酶(NOS)、NADPH 氧化酶、黃嘌呤氧化酶、脂氧合酶/環(huán)氧和各種物質(zhì)的氧化〔8〕。通常在生物體內(nèi)存在的抗氧化系統(tǒng)能夠清除部分ROS，維持代謝平衡；在一些損傷因素的作用下，體內(nèi)抵制ROS 的保護(hù)機(jī)制發(fā)生變化，誘導(dǎo)大量的自由基堆積，產(chǎn)生氧化和抗氧化的不平衡——氧化應(yīng)激；氧化應(yīng)激反應(yīng)可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氧化應(yīng)激作用參與細(xì)胞的凋亡，與目前文獻(xiàn)的報(bào)道一致〔10,11〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明氧化應(yīng)激作用加速細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流。目前對(duì)于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高的原因有很多解釋。本研究從Ca2+的相關(guān)信號(hào)通道研究發(fā)現(xiàn)，外源性的氧化應(yīng)激作用可以啟動(dòng)PKC、PI3K和CACNA2D1因子表達(dá)升高，從而介導(dǎo)細(xì)胞膜和線粒體Ca2+通道開(kāi)放，加速Ca2+內(nèi)流和線粒體Ca2+釋放，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+重新分布。

研究證明，H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制包括激活死亡受體信號(hào)通路和線粒體信號(hào)通路〔11～13〕。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激作用下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，肺癌細(xì)胞的ALK、KRAS和BAX凋亡相關(guān)基因的表達(dá)升高，但Bcl-2表達(dá)降低。在氧化應(yīng)激的作用下，Ca2+濃度變化啟動(dòng)了相關(guān)凋亡基因表達(dá)變化，當(dāng)ALK、KRAS和BAX凋亡相關(guān)基因表達(dá)升高必然啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡。ALK和KRAS與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ALK和KRAS的表達(dá)發(fā)生變化，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，當(dāng)KRAS和ALK表達(dá)升高從而降低抗凋亡Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而加速細(xì)胞的凋亡。促凋亡蛋白BAX轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，促進(jìn)線粒體內(nèi)的凋亡蛋白釋放；抗凋亡Bcl-2蛋白在氧化應(yīng)激的作用下表達(dá)降低，而促凋亡蛋白BAX表達(dá)升高，從而解釋了細(xì)胞凋亡的原因。

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