姚 蕾，李雨勤，吳永亮，黎威巍，金科華

(湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

血漿蛋白電泳圖譜的類型可為疾病的診斷提供依據(jù)，理想的電泳條帶是提供診斷依據(jù)的前提。電泳條帶不清晰，條帶數(shù)量少均導(dǎo)致定量困難，從而無法提供診斷依據(jù)。為此，優(yōu)化影響電泳的因素，提高電泳分離效果十分必要。血漿蛋白醋酸纖維薄膜電泳(簡(jiǎn)稱電泳)實(shí)驗(yàn)常用蓋玻片或X光膠片點(diǎn)樣，用pH8.6、離子強(qiáng)度0.06的巴比妥-巴比妥鈉緩沖液電泳[1]。這些點(diǎn)樣材料和緩沖液有不少弊端：首先，血漿在蓋玻片和X光膠片上難以分布均勻，以致無法形成整齊的點(diǎn)樣線，造成電泳條帶數(shù)量少、條帶不清晰、條帶畸形；其次，巴比妥鈉有毒[2]，價(jià)格昂貴，不易采購；此外，巴比妥緩沖液電泳分離的條帶間距小，很難得到6條帶，不便于后續(xù)各類蛋白的定量。為此，本研究擬比較點(diǎn)樣材料、磷酸緩沖液緩濃度及點(diǎn)樣量對(duì)電泳效果的影響，確定最佳點(diǎn)樣材料、最適緩沖液濃度和最適點(diǎn)樣量，從而建立理想的電泳體系，為后續(xù)的條帶定量和臨床疾病診斷奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DYY-6C電泳儀電源、DYCP-38C電泳槽購自北京六一儀器廠；8cm×2cm乙酸纖維素薄膜(簡(jiǎn)稱薄膜)為路橋四甲生化塑料廠產(chǎn)品；30cm×30cm雙圈牌濾紙為杭州沃華濾紙有限公司產(chǎn)品；No.0015厚層訂書為得力集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

分析純Na2HPO4、KH2PO4分別為天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司、廣東西隴化工廠產(chǎn)品；氨基黑、無水乙醇為國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無水甲醇為廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心產(chǎn)品；冰乙酸為天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品。據(jù)劉漢才的方法[3]配制pH8.67 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液(簡(jiǎn)稱緩沖液)；按孫聰?shù)姆椒╗4]配制染色液、漂洗液。

抽取本文作者吳永亮靜脈血15mL，分裝于含枸櫞酸鈉的抗凝管，4℃4000r/min離心10min，取上層血漿小份分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 薄膜的準(zhǔn)備與搭橋

將薄膜糙面朝下逐條放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中，用鑷子輕壓薄膜的表面，使其浸泡在緩沖液中30min以上。取出浸泡的薄膜，置于緩沖液潤(rùn)濕的濾紙上[5]，吸取多余的水分[6]。向電解槽的正負(fù)極加等高的緩沖液[7]。用雙層濾紙搭橋，濾紙與槽緊貼，無氣泡，表面平整。

1.3 點(diǎn)樣、平衡及電泳

將浸泡好的薄膜置于潤(rùn)濕的濾紙上，用三種材料點(diǎn)樣。①濾紙條點(diǎn)樣。將濾紙裁剪成1cm×1mm的小條，用緩沖液潤(rùn)濕，貼于薄膜點(diǎn)樣處(距一端約2cm，下同)，用移液器取血漿均勻涂布于濾紙條上。點(diǎn)樣完畢，用紙巾吸取薄膜下濾紙的水分，使血漿加速滲入薄膜內(nèi)。②火車票點(diǎn)樣。將磁質(zhì)火車票橫向裁成寬1cm的條，用移液器取血漿均勻涂布于火車票1cm的橫截面，將火車票血漿印于點(diǎn)樣處。③訂書釘點(diǎn)樣。用橡皮擦固定訂書釘?shù)膬啥?，將血漿均勻涂布于訂書釘上，再將血漿印于點(diǎn)樣處。薄膜點(diǎn)樣端置于電泳槽負(fù)極，粗面向下，平整垂直地貼于濾紙橋上，平衡5～15min[8]，110V電泳40min。

1.4 染色與漂洗

電泳后的薄膜放入染色液中染色10min，取出薄膜于漂洗液中連續(xù)漂洗數(shù)次，直至條帶清晰，背景干凈。

1.5 探索最佳點(diǎn)樣材料

取2μL血漿，按1.3分別用濾紙條、火車票和訂書釘點(diǎn)樣，在0.25×的緩沖液中電泳，比較不同點(diǎn)樣材料分離的條帶數(shù)量和清晰度，確定最佳點(diǎn)樣材料。

1.6 探索最佳緩沖液濃度

將1×緩沖液依次稀釋2倍(0.5×)、3倍(0.33×)、4倍(0.25×)、5倍(0.2×)，用最佳點(diǎn)樣材料點(diǎn)樣2μL血漿，分別在不同稀釋倍數(shù)的緩沖液中電泳，比較分離的條帶數(shù)量和清晰度，確定最佳緩沖液濃度。

1.7 探索最佳點(diǎn)樣量

分別取0.5、1、2、3、4μL血漿，用最佳點(diǎn)樣材料點(diǎn)樣，在最佳濃度的緩沖液中電泳，比較分離的條帶數(shù)量和清晰度，獲得最佳點(diǎn)樣量。

2 結(jié) 果

2.1 濾紙條點(diǎn)樣電泳效果最好

濾紙條、火車票和訂書釘點(diǎn)2μL血漿的薄膜，用0.25×緩沖液電泳，結(jié)果見圖1(封二)，由圖可知膜a、b均有6條帶；但膜b中的條帶拖尾明顯；膜c只見顏色較淺的5條帶。由此認(rèn)為濾紙條點(diǎn)樣效果最好。

2.2 0.5×緩沖液電泳效果最好

用濾紙條點(diǎn)2μL血漿的薄膜，在1×、0.5×、0.33×、0.25×、0.2×緩沖液中電泳結(jié)果見圖2(封二)。由圖可知，膜b、c、d上均有6條帶；膜a只見5條帶，且間距短，條帶重疊；膜e只見4條帶，且條帶很淡。隨著緩沖液濃度降低，條帶間距增大，條帶拖尾愈明顯。0.5×緩沖液的結(jié)果條帶間距適中、清晰度最佳。

2.3 2μL血漿電泳效果最好

用濾紙條分別點(diǎn)0.5、1、2、3、4μL血漿，行0.5×緩沖液電泳，結(jié)果見圖3(封二)。由圖可知，膜b、c、d、e均有6條帶；而膜a只見5條帶，且條帶很淡；隨點(diǎn)樣量增多，條帶顏色逐漸加深，拖尾現(xiàn)象愈發(fā)明顯。點(diǎn)2μL血漿的薄膜電泳條帶顏色及間距適中，清晰度最佳。

3 討 論

文獻(xiàn)報(bào)道巴比妥緩沖液在離子強(qiáng)度為0.06～0.09時(shí)血清電泳效果較好[6]，而本研究發(fā)現(xiàn)稀釋兩倍的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液電泳效果最好，其離子強(qiáng)度為0.098，超過上述最適離子強(qiáng)度范圍的上限。為此，我們推測(cè)電泳緩沖液最適離子強(qiáng)度可能因緩沖液種類不同而異。此外，本研究發(fā)現(xiàn)緩沖液最適離子強(qiáng)度由電泳血漿所得，與文獻(xiàn)電泳血清有所不同，最適緩沖液離子強(qiáng)度是否因電泳材料不同而異需要進(jìn)一步研究。

冀華等[9]發(fā)現(xiàn)訂書釘點(diǎn)樣的血清電泳后各蛋白質(zhì)條帶無明顯拖尾和擴(kuò)散現(xiàn)象，而本文發(fā)現(xiàn)訂書釘點(diǎn)樣的血漿電泳后僅有5條帶，且條帶很淡。訂書釘和磁質(zhì)火車票吸水性差，單次承載的最大血漿量分別為0.5和0.8μL，2μL血漿須多次點(diǎn)樣才能完成，多次點(diǎn)樣易導(dǎo)致點(diǎn)樣點(diǎn)偏移，從而導(dǎo)致電泳效果不佳。

本研究有三大創(chuàng)新：一是用濾紙條點(diǎn)樣；二是磷酸緩沖液替代有毒的巴比妥緩沖液；三是確定最佳緩沖液濃度。用濾紙條點(diǎn)樣可固定點(diǎn)樣點(diǎn)，控制點(diǎn)樣量，獲得均勻、整齊的點(diǎn)樣線，電泳條帶更清晰；配制磷酸緩沖液所需試劑廉價(jià)、無毒，易于購買；稀釋緩沖液既能改善電泳效果，又能減少試劑用量、降低實(shí)驗(yàn)成本。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化了血漿醋酸纖維薄膜電泳的三個(gè)因素：最佳點(diǎn)樣材料為濾紙條，最佳緩沖液濃度為0.5×緩沖液，最佳點(diǎn)樣量為2μL。實(shí)驗(yàn)建立了理想的電泳體系，為基于血漿蛋白電泳條帶定量的疾病診斷提供了可靠的技術(shù)保障。