喻敏成+徐泱

摘 要 近年來腫瘤干細胞正逐漸成為研究焦點。越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細胞與腫瘤的形成、進展、轉移、復發(fā)與治療失敗存在密切聯(lián)系。本文主要就腫瘤干細胞假說的起源、上皮間充質轉換、CD44與腫瘤干細胞的聯(lián)系、腫瘤干細胞抵抗治療的可能機制、腫瘤干細胞的信號通路及其治療啟示等五個方面展開論述。

關鍵詞 腫瘤干細胞 上皮間充質轉換 CD44 信號通路 腫瘤治療

中圖分類號：R730.231 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）15-0028-04

Research progress of cancer stem cells*

YU Mincheng**， XU Yang***

（Department of Liver Surgery， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT Cancer stem cells （CSCs） have been the subject of intensive discussion and investigation for decades. Accumulated evidence indicates that CSCs play a crucial role in tumor initiation， propagation， metastasis， recurrence and therapy failure. In this review， we summarize the brief history of modern CSCs research， the importance of epithelial-to-mesenchymal transition in conferring CSCs properties， CD44 in CSCs as a promising biomarker and therapeutic target， the mechanisms by which CSCs may resist cancer therapy， signaling pathways involved in maintenance of the CSCs state and its clinical implications for cancer therapy.

KEY WORDS cancer stem cell； epithelial-to-mesenchymal transition； CD44； signaling pathway； cancer therapy

腫瘤干細胞（cancer stem cells， CSCs）假說提出腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中小部分具有干細胞性質的細胞亞群，并能通過不對稱分裂，產(chǎn)生保留有相同性質的CSCs以及不同分化程度的、占腫瘤大部分的非致瘤性腫瘤細胞[1]。腫瘤內部的異質性是推動腫瘤進展、轉移、復發(fā)以及影響腫瘤治療和預后的可能原因。而CSCs假說則為解釋腫瘤內部的異質性提供了一個新的思路。

1 CSCs概述

1937年Furth等[2]將小鼠單個白血病細胞移植到另一只近親小鼠并成功導致其發(fā)生白血病，并提出不是所有的腫瘤細胞均具有致瘤能力。90年代Dick等[3]通過采用系列移植及熒光激活細胞分選技術首次在急性髓性白血?。ˋML）中證實了腫瘤內部存在等級分層，分離自AML患者的CD34++ /CD38-細胞亞群能在非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠模型中重新形成AML，從而為CSCs假說奠定基礎。隨后在乳腺、腦、前列腺、卵巢、結腸、肝臟、肺和胰腺等實體瘤中均發(fā)現(xiàn)了相應的CSCs，CSCs假說得到進一步完善。但上述異種移植實驗反映的是腫瘤細胞的致瘤潛能而非真實的細胞命運決定。為克服腫瘤微環(huán)境改變對實驗結果的影響，2012年3項獨立研究通過采用譜系示蹤技術分別追蹤小鼠皮膚鱗癌、小腸腺癌、腦膠質瘤中的細胞命運，為腫瘤內部存在等級分層、CSCs具有干細胞特性即自我更新和多向分化形成整個腫瘤的能力提供了直接證據(jù)。

2 CSCs與EMT

2.1 EMT概述

上皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）即上皮表型細胞轉分化為間充質表型細胞的過程[4]。上皮性惡性腫瘤細胞經(jīng)過EMT程序后能解除機體對抗腫瘤的防御機制、抑制凋亡、增加轉移侵襲的能力，同時也是腫瘤耐藥、腫瘤細胞群體擴充的來源之一。2005年Brabletz等[5]在研究結直腸癌進展時，發(fā)現(xiàn)腫瘤-宿主界面的腫瘤細胞同時表達“干性”相關基因和EMT相關基因，并將該腫瘤細胞稱作“移行腫瘤干細胞”，提示CSCs與EMT之間存在聯(lián)系。2008年Mani等[6]發(fā)現(xiàn)通過異位表達Twist和Snail轉錄因子激活EMT程序能使乳腺上皮癌細胞轉變?yōu)镃SCs樣細胞（表達CD44+CD24-表型且具有體外成球的能力），且分離自乳腺上皮癌的CSCs表達EMT標志物。上述結果第一次為EMT和CSCs的產(chǎn)生提供了直接聯(lián)系?，F(xiàn)已在體內體外試驗中證實很多其他上皮癌細胞中誘導EMT轉錄因子過度表達亦可產(chǎn)生CSCs的分子表型和功能上的特點[7]。同時，參與EMT調控的信號通路如Wnt、Notch以及Hedgehog同樣也能推動CSCs的維持和自我更新。因此，激活EMT程序是腫瘤細胞獲得、維持CSCs特性以及擴大CSCs池的分子基礎。阻斷EMT信號通路可成為以CSCs為靶向的一種抗腫瘤治療方式。研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌中PI3K/Akt/mTOR胞內信號轉導通路組成性激活能使CD44v6表型的結直腸CSCs表達EMT相關基因，抑制PI3K通路則能選擇性殺傷CD44v6表型的結直腸CSCs以及降低腫瘤的轉移生長能力。b-catenin是直接參與誘導EMT的轉錄因子，一些臨床試驗通過應用BMPs拮抗b-catenin的激活來抑制結直腸CSCs中的EMT基因，從而促進結直腸CSCs的分化、凋亡以及對化療藥物敏感。另外，用ROR1特異性單克隆抗體能抑制CSCs中EMT相關基因的表達降低卵巢癌小鼠中的轉移灶。

2.2 miRNA對EMT及CSCs的調控

miRNA是造成腫瘤異質性的來源之一，對EMT以及CSCs均具有一定的調控作用。miR200-ZEB1軸被認為是參與EMT調控的核心機制之一[4]，miR-200家族成員能通過抑制轉錄因子ZEB1/2的表達進而抑制EMT。此外研究發(fā)現(xiàn)miR-200家族成員亦能通過抑制Bmi-1的表達有效抑制EMT以及腫瘤的遠處轉移。Bmi-1與EMT轉錄因子Twist-1在誘導EMT過程中互為必須。Bmi-1作為HH信號轉導通路下游的轉錄因子，對調節(jié)CSCs的自我更新同樣至關重要。研究發(fā)現(xiàn)miR-200家族成員能抑制乳腺癌中CSCs的形成，反之乳腺CSCs中miR-200家族成員大幅下調。因此miR-200參與EMT和 CSCs的共同調控。同樣，miR-34和Let-7也有相似調控作用：miR-34能直接參與胰腺CSCs自我更新的調控，對細胞命運決定有重要作用。而miR34-SNAIL1軸作為非編碼RNA參與EMT調控的另一核心機制[4]，miR-34也能通過作用于SNAIL抑制上皮腫瘤細胞的EMT程序。Let-7能調控乳腺腫瘤細胞的自我更新以及成瘤能力。口腔鱗癌中，Lin28/Let-7軸能誘導“干性”基因如Oct4/ Sox的表達調控CSCs，同時，let-7d也能抑制EMT程序。對吉西他濱耐藥（GR）的胰腺癌細胞常獲得間充質表型，且具有自我更新的特性，研究發(fā)現(xiàn)該細胞中l(wèi)et-7家族的表達大幅下調。上述研究均提示miRNA可能是連結EMT與CSCs的樞紐。此外，近年研究顯示miRNAs、EMT以及CSCs均參與腫瘤細胞耐藥的調節(jié)[8]。因此以miRNAs為靶點的抗腫瘤治療是使耐藥腫瘤細胞重新對化療敏感的一種可行治療方式。

2.3 腫瘤微環(huán)境對EMT和CSCs的調控

腫瘤細胞EMT程序的激活大多來自腫瘤微環(huán)境中的刺激，這些刺激主要分為五類：低氧和低pH；固有和適應性免疫應答；機械應激；細胞外基質（extracellular matrix， ECM）改變以及抗腫瘤藥物的使用[9]。腫瘤細胞對低氧的應答主要由HIFs轉錄因子家族介導。低氧/ HIF-1軸作為多條信號通路的樞紐，共同參與EMT與CSCs的調控[10]。低氧能通過穩(wěn)定和/或表達HIF-1a亞基使HIF-1活化，活化后的HIF-1最終能誘導多個EMT主轉錄因子如Twist、Snail、Slug、ZEB1/2的表達從而激活EMT程序。多個研究發(fā)現(xiàn)參與CSCs狀態(tài)維持的信號通路如Notch、Wnt/b-catenin、TGF-b等在低氧/HIF-1誘導的EMT中具有重要作用[8]。CSCs“巢”（niche）是位于腫瘤微環(huán)境中的一個特殊的解剖學區(qū)域，對調控CSCs的命運決定至關重要[11]。低氧作為CSCs巢的特點現(xiàn)已在多個腫瘤類型中得到證實[8]。低氧能通過激活HIF-1誘導Oct-4、Sox-2、Nanog、Myc、CD44和CD133等多個CSCs相關基因的表達，同時也能提高腫瘤細胞自我更新以及成瘤能力。體內敲除實驗發(fā)現(xiàn)CSCs的存活需要HIF-1，體外實驗中HIF-1的活性降低則能使CSCs失去成瘤能力。HIF-1a還能通過拮抗c-Myc減慢細胞周期進展，保護CSCs免受DNA損傷以及增加細胞干性。上述研究結果均提示低氧/HIF-1軸是擴大并維持CSCs群體的機制之一。另外，HIF-1還與ROS的產(chǎn)生及激活密切相關。低氧條件下，腫瘤細胞內活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）含量增加，ROS激活的應激反應通路以及ROS參與誘導的TGF-b和TNF-a通路能共同促進EMT程序以及CSCs生存。因此以HIF-1作為抗腫瘤治療的靶點，理論上來說，不僅可抑制EMT程序，同時能通過促進CSCs分化從而減少CSCs群體。

值得注意的是，EMT程序的激活并非微環(huán)境刺激直接作用的結果，而是以自分泌或旁分泌因子作為胞外介質介導的腫瘤細胞、腫瘤相關細胞與腫瘤基質之間的相互作用。因此腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關細胞也參與誘導EMT程序[9]。這些細胞不僅包括占腫瘤基質絕大部分的纖維細胞和成肌纖維細胞，還包括與炎癥及愈合相關的細胞[12]。有趣的是，部分上述細胞如成肌纖維細胞、間充質干細胞（MCSs）及腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）也可同樣通過激活干細胞相關基因參與CSCs的形成與維持[13]。因此腫瘤微環(huán)境的作用進一步提示EMT程序的激活與CSCs存在密切聯(lián)系。

3 CSCs與CD44

CD44是單跨膜糖蛋白家族中的一員，結構和功能各異?，F(xiàn)已證實CD44是一個典型的CSCs表面標志物，單獨或與其他標志物如CD24、CD133和CD34等聯(lián)合使用，可用于富集多種類型腫瘤的CSCs。近年來研究發(fā)現(xiàn)相比于CD44s亞型，CD44v亞型作為CSCs標志物更為適用[14]。CD44可通過抑制PKM2活動或穩(wěn)定xCT這兩種途徑誘導CSCs進入抗氧化狀態(tài)（GSH增加，ROS降低），進而阻止ROS誘導的腫瘤細胞衰老、凋亡或分化[15]。因此，CD44也可成為清除CSCs群體的治療靶點。有關以CD44為靶向的治療方式一方面可基于抗CD44抗體的使用，另一方面可通過阻斷透明質酸與CD44結合，抑制腫瘤的生長和轉移。另外，CD44也可作為腫瘤的預后標志物。2014年一項薈萃分析發(fā)現(xiàn)，胃癌中CD44的表達與TNM分期、淋巴結、遠處轉移和總體生存率降低有關。同樣，CD44也可作為肺癌、結直腸癌、乳腺癌、肝癌、頭頸癌、咽下鱗癌等腫瘤的預后標志物[14]。然而，值得注意的是CD44的預后價值在不同腫瘤中存在差異，CD44的表達并不一定意味著腫瘤進展的可能性增加。如一項研究顯示侵犯至漿膜下層的結直腸癌細胞CD44表達缺失卻能夠很好的預測遠處淋巴結以及肝臟的轉移。綜上所述，CD44尤其是CD44v亞型參與調節(jié)CSCs多方面性質，包括自我更新、成瘤能力、遠處轉移和化療抵抗。因此既可作為清除CSCs的治療靶點，又兼具腫瘤的診斷價值和預后價值。

4 CSCs與治療抵抗

4.1 ABC轉運子

通過流式細胞術分選出具有快速排出熒光染料Hoechst33342能力的細胞稱之為側群細胞（side populations）。由于側群細胞具備自我更新及體外成瘤等CSCs性質，現(xiàn)已被廣泛應用于CSCs的分離與鑒定。參與上述藥物模擬染料排出的ABC轉運蛋白家族是CSCs多藥耐藥的重要機制之一，其中研究得較為廣泛的主要有ABCB1（MDR1）、ABCC1（MRP1）、ABCG2（BCRP）。它們能依賴ATP將胞內多種化療藥物如紫杉烷類、拓撲異構酶類抑制劑以及抗代謝物泵出，使胞內藥物濃度低于細胞毒性水平。研究顯示CSCs高表達上述ABC轉運蛋白家族[16]。如PTEN/PI3K/Akt信號通路可調控人和小鼠神經(jīng)膠質瘤CSCs表達ABCG2轉運蛋白，使之對神經(jīng)膠質瘤一線用藥替莫唑胺耐藥。

4.2 ALDH

在很多類型腫瘤中，醛脫氫酶（ALDH）被認為是CSCs的主要標志物。ALDH的活性提高與CSCs的放化療抵抗有關，ALDH介導的治療抵抗包含多個復雜機制。ALDH催化醛磷酰胺氧化生成羧基磷酰胺的過程是環(huán)磷酰胺等化療藥物的主要解毒機制。ALDH在氧化應激反應中能直接清除放療誘導產(chǎn)生的自由基或產(chǎn)生抗氧化劑NAD（P）H。此外，ALDH的活性還與激活PI3K/AKT和MAPK/ERK促生存信號通路有關。最近一項研究顯示用全反式維甲酸（ATRA）抑制ALDH的活性能誘導頭頸鱗狀細胞癌CSCs的分化和增加對放療的敏感性。

4.3 DNA的損傷修復

放療及大多數(shù)化療藥物能通過誘導DNA損傷導致腫瘤細胞死亡，而多項證據(jù)表明CSCs能保護自身免受DNA損傷的影響。放療可使腫瘤細胞過度產(chǎn)生ROS最終損害包括DNA在內的關鍵分子。研究顯示在乳腺癌和胃腸腫瘤中，與非CSCs相比，CSCs具備更為高效的ROS清除系統(tǒng)及更低水平的ROS。放化療后DNA損傷監(jiān)測蛋白和修復蛋白如ATM、Chk1/2、p53、BRCAs以及XRCC5只在CSCs中異常激活或過度表達[17]，使用ATM或Chk1抑制劑可分別使乳腺癌CSCs對放療敏感或使胰腺癌CSCs對化療藥物吉西他濱敏感。同時，放療還能延長CSCs分裂周期增加DNA修復時間。因此，上述研究結果提示CSCs主要通過調控細胞周期狀態(tài)；提高DNA損傷修復能力以及高效清除ROS三種機制抵抗DNA損傷。

4.4 其他機制

大多數(shù)CSCs處于相對靜止或休眠狀態(tài)，因此對以快速增殖細胞為靶點的化療方式不敏感。上皮性腫瘤細胞經(jīng)過EMT程序后（獲得CSCs）通常對治療方式具有更強的抵抗能力，部分通過表達耐藥相關基因[4]。過度表達促生存通路如Wnt、Notch、Hedgehog等同樣能增加CSCs抵抗放化療的能力。放化療也可通過激活CSCs自噬作用以維持代謝穩(wěn)態(tài)和提高惡劣環(huán)境下的生存能力。如前所述，CSCs存在于腫瘤微環(huán)境中的特殊區(qū)域，CSCs巢同樣也是導致CSCs治療抵抗的原因之一。

5 CSCs與靶向治療

Wnt、Notch以及Hedgehog這三條通路是原始的、進化上高度保守的細胞命運決定信號通路，CSCs的特點包括上述一條或多條信號通路的持續(xù)性激活[18]。這些為CSCs提供支持的關鍵信號通路為精確分子治療提供了潛在的靶點。

5.1 wnt通路相關的靶向藥物

除FDA已批準的Wnt通路非特異性抑制劑如非甾體類抗炎藥物以及維生素類衍生物外，許多靶向藥物均已進入早期臨床試驗[19]。小分子類抑制劑如ICG-001及第二代復合物PRI-724，能與CREB結合蛋白（CBP）特異性結合阻斷CBP依賴性基因表達；LGK974作為Porcupine酶抑制劑現(xiàn)已進入臨床一期實驗，可以阻斷Wnt配體的脂質化修飾和分泌。單克隆抗體類藥物如OMP-54F28能通過結合Fzd8受體的配體阻斷Wnt信號通路，OMP-18R5則能通過結合至少5個Fzd受體直接阻斷Wnt信號通路。但至今沒有能特異性有效靶向該信號通路的藥物上市。Wnt信號通路在進化上高度保守，有關該通路的靶向治療常因其關鍵成分在其他功能方面具有冗余性而變得困難。如b-catenin作為潛在治療靶點，同樣能與E-cadherin相互作用參與細胞黏附。另外，該通路還與多個參與細胞穩(wěn)態(tài)維持的關鍵功能有關，這意味著有關該通路的靶向治療會帶來潛在的嚴重不良后果如胃腸道毒性、貧血以及免疫抑制等[20]。

5.2 Notch信號通路相關的靶向藥物

在眾多特異性靶向Notch通路關鍵成分的單克隆藥物之中，demcizumab（OMP-21M18）和tarextumab（OMP-59R5）是現(xiàn)今臨床試驗級別最高的藥物（均已進入臨床二期試驗）。研究發(fā)現(xiàn)有關抗Dll4單克隆抗體demcizumab的作用機制主要來自三個方面：抑制功能性腫瘤血管生成、減少CSCs的數(shù)量以及調節(jié)抗腫瘤的免疫反應。另一類小分子抑制劑如g-分泌酶抑制劑（GSIs）同樣也進入了早期臨床試驗，其作用機理為抑制Notch受體的最后一步裂解。然而GSIs有關的臨床研究進展受到治療相關毒性尤其是胃腸道嚴重不良反應的阻礙[21]。

5.3 Hedgehog信號通路相關的靶向藥物

臨床前期試驗顯示與Hh通路有關的靶向治療方式能阻斷CSCs相關的耐藥、轉移和復發(fā)[22]。阻斷Hh信號通路的機制包括抑制SMO、中斷受體配體間相互作用、阻斷配體的形成過程以及抑制GLI。其中，SMO抑制劑對包含SMO或PTCH變異的成神經(jīng)管細胞瘤和基底細胞癌尤其有效。環(huán)巴明（cyclopamine）作為自然發(fā)生的SMO抑制劑因效價強度和生物利用度不高限制其進一步的臨床使用。目前Hh通路靶向藥物中臨床級別最高的是SMO抑制劑vismodegib，2012年經(jīng)FDA批準用于轉移性BCCs和原發(fā)BCCs已不適合手術或放療的病人。但該藥物在其他的腫瘤應用中卻極為有限，其可能原因在于早期試驗缺乏對病人分層、Hh通路與其他致癌基因信號通路相互作用以及對大多數(shù)CSCs的Hh信號通路激活機制缺乏了解。

綜上所述，CSCs假說為腫瘤傳統(tǒng)治療方式的失敗提供了解釋。雖然以CSCs信號通路為靶向的治療富有前景。但信號通路之間存在的相互作用給以CSCs為靶向的治療方式帶來了挑戰(zhàn)和機遇。一方面意味著靶向單個信號通路將導致多個信號通路級聯(lián)阻滯。另一方面這同樣也成為CSCs逃避治療的機制之一（上調相關的互補通路）。因此聯(lián)合用藥和適合的病人等級分層是可能的解決方式之一。

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