菅志遠，沈先鋒，方 程，高 義

1. 十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院) 肝膽胰外科診療中心，湖北 十堰 442000；2. 武漢大學中南醫(yī)院 循證與轉化醫(yī)學中心，武漢 430071

EphA2在結直腸癌細胞中的生物學功能及其信號調控機制

菅志遠1，沈先鋒1，方 程2，高 義1

1. 十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院) 肝膽胰外科診療中心，湖北 十堰 442000；2. 武漢大學中南醫(yī)院 循證與轉化醫(yī)學中心，武漢 430071

〔目的〕探討EphA2在結直腸癌細胞中的生物學功能及其信號調控機制?！卜椒ā硄RT-PCR法檢測EphA2在結直腸癌細胞系中的表達情況，篩選得到表達量較高細胞株系，利用siRNA沉默該細胞系中EphA2的表達，利用MTT、Transwell、Western blot、qRT-PCR法檢測細胞生物學功能變化及Wnt/β-catenin信號通路相關基因及蛋白的表達變化。〔結果〕在人結腸癌細胞HCT116、HT29和SW480中篩選得到EphA2高表達細胞HCT116，構建載體EphA2-siRNA并成功轉染細胞HCT116。MTT、Transwell法檢測結果顯示，與對照組相比，EphA2-siRNA組中細胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。qRT-PCR和westernblot分析表明，與對照組相比，EphA2-siRNA組中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白E-cadherin、TCF-4、β-catenin和p-GSK-3βSer9的表達量均呈現(xiàn)下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?！步Y論〕 結直腸癌細胞中EphA2的表達與結直腸癌的進展和侵襲轉移密切相關，EphA2可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路影響結直腸癌的進展。

EphA2；Wnt/β-catenin信號通路；結直腸癌

結直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。近幾年，結直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，嚴重威脅著人們的健康[1]。外科手術治療、放療、化療等綜合治療措施的應用使結直腸癌的治愈率有了很大提高，但癌細胞遠處轉移仍然導致大多數(shù)患者復發(fā)、死亡[2]。Eph基因家族，具有受體酷氨酸激酶的活性，在對腫瘤細胞生長、增殖、轉移等相關的信號轉導通路的調控過程中起到關鍵性的作用[3]。EphA2是Eph家族中的一員，研究[4]發(fā)現(xiàn)，該基因在多種腫瘤中高表達，并與腫瘤的轉移和患者的預后密切相關。本研究通過檢測EphA2在結直腸癌細胞系中的表達情況，利用siRNA沉默結直腸癌細胞EphA2的表達，檢測細胞生物學功能變化及Wnt/β-catenin信號通路相關基因及蛋白的表達變化，闡述EphA2可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路影響結直腸癌的進展。

1 材料與方法

1.1 細胞株與藥物

結直腸癌細胞系HCT116、HT29、SW480購自中國科學院上海細胞生物所；1640培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000以及siRNA購于美國Therm公司；MTT試劑、抗EphA2單抗以及二抗購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；CO2培養(yǎng)箱和SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)購自美國Therm公司；7700型實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 細胞株及培養(yǎng)

結直腸癌細胞系HCT116、HT29、SW480，培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%的胎牛血清1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；1～2 d更換培養(yǎng)基，2～4 d用體積分數(shù)為0.25%的胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染

將生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期HCT116細胞消化稀釋，將稀釋后的siRNA與LipofectamineTM2000混合，室溫靜置20 min，使之充分混勻；將上述混合液加入6孔板，即維持siRNA轉染濃度50 mmol/L，輕輕晃動培養(yǎng)板，充分混勻，6 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 qRT-PCR檢測EphA2 mRNA的表達

北方欠發(fā)達地區(qū)由于水資源短缺，工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受到影響，如甘肅石羊河流域的農(nóng)田大面積無法耕種，煤化工等耗水產(chǎn)業(yè)不能就近布局。南方部分欠發(fā)達省份的一些地區(qū)受水污染影響，農(nóng)田無法耕種，“癌癥村”出現(xiàn)，城市不得不舍近求遠尋找新水源?？梢?，欠發(fā)達地區(qū)經(jīng)濟社會發(fā)展受到的水資源制約也日趨明顯。

收集對數(shù)期細胞，提取總RNA，合成cDNA, 使用ABI 7900HTSequence Detection System進行PCR反應，數(shù)據(jù)應用2-ΔΔCt分析。內參基因為GAPDH。

1.5 MTT法檢測細胞增殖

接種細胞，調整細胞濃度1×104/mL，每孔吸取200 μL加入96孔板；放入CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液1次；按實驗既定時間點，分別培養(yǎng)至24、48、72 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h；吸棄孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，充分溶解紫色結晶物；酶聯(lián)免疫檢測儀處測定各孔OD值，波長設置為450 nm。

1.6 Western blot 檢測各受體蛋白的表達

收集對數(shù)期生長細胞，破碎細胞提取蛋白，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，依次加一抗、二抗孵育洗膜，成像儀檢測結果。具體實驗方法參照已發(fā)表文章[5]。

1.7 Transwell檢測細胞的侵襲和遷移能力

1.8 統(tǒng)計學分析

定量變量用mean±SD表示，組間比較采用t檢驗或非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。分析EphA2對結直腸癌細胞HCT116的增殖、侵襲和遷移的影響，比較各受體蛋白、mRNA表達的影響。

2 結果

2.1EphA2在HCT116細胞中高表達

使用qRT-PCR檢測EphA2在人結腸癌細胞HCT116、HT29和SW480中的表達。結果顯示，在HCT116中EphA2mRNA的表達水平高于其他細胞(圖1)。因此，選擇HCT116細胞進行研究。

圖1 EphA2在各結直腸癌細胞系中的表達情況

2.2 干擾EphA2表達抑制HCT116細胞的增殖

在HCT116細胞中轉染siRNA，干擾EphA2表達，并用MTT檢測對細胞增殖的影響，結果顯示，與對照組相比，EphA2-siRNA組中細胞的增殖受到抑制，且差異顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2 EphA2不同表達量對于細胞增殖能力的影響

2.3 干擾EphA2 抑制HCT116細胞的侵襲和遷移能力

為了評價EphA2對結直腸癌細胞侵襲及遷移能力的影響，我們分別進行了鋪或不鋪Matrigel的Transwell實驗。發(fā)現(xiàn)，轉染EphA2-siRNA的HCT116細胞轉移至小室下層的細胞數(shù)顯著少于對照組，差異明顯(P<0.05)，見圖3。表明干擾EphA2的表達可以抑制HCT116細胞的侵襲和遷移能力。

圖3 EphA2對結直腸癌細胞侵襲和遷移能力的影響

2.4EphA2-siRNA對Wnt/β-catenin通路中E-cadherin、TCF-4及β-catenin表達的影響

利用qRT-PCR和westernblot實驗分別檢測EphA2-siRNA組、EphA2-non組和Blank(空白)組中E-cadherin、TCF-4及β-catenin蛋白的表達情況。qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，EphA2-siRNA組中3種mRNA的表達均下降，且結果差異顯著(P<0.05)，見圖4。

圖4 不同表達量的EphA2對Wnt/β-catenin通路中3種蛋白表達量的影響

Westernblot結果也一樣，跟對照組相比3種蛋白的表達均有所下降，見表1。

表1 western blot 實驗檢測3種蛋白條帶強弱百分比(%)

2.5EphA2-siRNA對HCT116細胞GSK-3β和磷酸化GSK-3βSer9表達變化的影響

采用westernblot方法分別檢測GSK-3β和磷酸化p-GSK-3βSer9蛋白表達情況。結果顯示，EphA2-siRNA組，EphA2-non組和Blank(空白)3組中，GSK-3β蛋白條帶亮度無明顯差別；而p-GSK-3βSer9蛋白條帶亮度有明顯差異 ，與對照組相比，p-GSK-3βSer9在EphA2-siRNA組的表達水平下降。見表2。

表2 western blot 檢測GSK-3β、p-GSK-3βSer9 蛋白條帶強弱百分比(%)

3 討論

隨著生活習慣及生存環(huán)境的變化，癌癥發(fā)病率持續(xù)增高，結直腸癌作為一種常見的消化道腫瘤，已經(jīng)嚴重威脅到人類的健康[6]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織近年的研究報告，2012年全球約有136萬人被確診為結直腸癌，其數(shù)量之大使結直腸癌在惡性腫瘤中排名前3位，僅次于肺癌和乳腺癌。此外，統(tǒng)計結果[7]顯示，約有69萬結直腸癌患者死亡，位居所有惡性腫瘤第4位。更令人擔憂的是，結直腸癌在全球的發(fā)病率及死亡率不斷攀升，且發(fā)病的地域分布也存在很大差異。據(jù)統(tǒng)計，結直腸癌在我國的發(fā)病率也呈逐年遞增的趨勢，嚴重威脅著人類的生命安全，給社會造成了極大的壓力。隨著科學技術的飛速發(fā)展，已經(jīng)有很多先進的技術可以應用到癌癥的治療當中，其中主要包括了手術治療、化學藥物治療以及放射性療法。雖然這些方法也被應用到結直腸癌的治療中，但是，目前此疾病的預后仍不樂觀[8]。因此，對于疾病發(fā)生和發(fā)展相關的分子及分子機制的研究，對于進一步探究結直腸癌的治療靶位點以及完善發(fā)展此疾病的治療方法具有重要的意義。

EphA2屬于目前已知的受體酪氨酸激酶(RTKs)最大亞族Eph基因家族，具有重要的受體酪氨酸激酶活性，因此參與了眾多的細胞生物學過程[9]。在癌癥細胞中，Christiansen等[3]發(fā)現(xiàn)，Eph基因在腫瘤細胞的生長、分化、增殖和遷移等過程中具有重要作用，參與了某些癌癥的發(fā)生及發(fā)展過程。Cui等[10]研究表明，EphA2高表達于很多上皮來源的腫瘤中，并且可以在一定程度上影響腫瘤的轉移以及癌癥預后。在胃癌相關研究中，癌癥樣品檢測到了表達量顯著增加的EphA2基因，并通過體外細胞實驗證明了高表達的EphA2可以通過Wnt/β-catenin信號通路促進胃癌細胞的上皮間質轉化[11]。對于結直腸癌，已有研究[12]證明EphA2可以作為有效的癌癥預后標志物。然而，EphA2在結直腸癌的生物學作用以及其發(fā)揮作用的機制研究尚不清楚。

本研究針對目前EphA2在癌癥中的研究成果，旨在進一步分析該基因在結直腸癌中的生物學功能以及潛在的信號調控機制。通過在結直腸癌細胞系中的研究，我們發(fā)現(xiàn)抑制EphA2的表達量可以顯著降低癌細胞的增殖能力。此外，Transwell實驗結果證明，抑制結直腸癌細胞EphA2的表達，細胞的侵襲和遷移同時也一定程度上有所降低。以上結果說明，EphA2參與了結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移的生物學過程，對癌癥的發(fā)生和發(fā)展具有重要的作用。同時，我們實驗還進一步探究了EphA2發(fā)揮作用潛在的生物學機制。通過使用qRT-PCR以及westernblot法對相關信號通路蛋白表達量的分析，我們證明了EphA2極有可能是通過Wnt/β-catenin信號通路影響結直腸癌細胞的生長和發(fā)展，從而參與到癌癥的進程當中。

綜合以上研究結果，我們證明了EphA2基因參與了結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移幾個生物學過程，并且通過潛在的Wnt/β-catenin信號通路途徑在結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程發(fā)揮重要的生物學功能。

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[責任編輯 時 紅]

Biological Functions and Regulatory Mechanisms of EphA2 in Colorectal Carcinoma

JIAN Zhiyuan1, SHEN Xianfeng1, FANG Cheng2, GAO Yi1

1. Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China; 2. Center for Evidence-Based and Translational Medicine, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China.

〔Objective〕To investigate the biological function and mechanism of EphA2 in colorectal cancer. 〔Methods〕The expression of EphA2 in colorectal cancer cell lines were detected by qRT-PCR, screened one cell lines with higher EphA2 expression. Silenced the expression of EphA2 in the cell line which we screened by siRNA technology.〔Results〕The results of MTT and Transwell analysis showed that inhibition of the EphA2 expression could suppress the proliferation, invasion and metastasis of the colorectal carcinoma cells (allP<0.05).AccordingtoqRTPCRandwesternblot,theexpressionofrelatedcrucialproteinofWnt/βcateninpathway,includingE-cadherin,TCF-4andβcatenin,andp-GSK-3βSer9weresignificantdecreasedintheEphA2-siRNAgroup(P<0.05forall). 〔Conclusion〕EphA2 was involved in the development of colorectal carcinoma, and it might participate the tumor progression mediated by Wnt/β catenin pathway.

EphA2; Wnt/β catenin signal path; colorectal carcinoma

1672-7606(2017)02-0115-04

2017-02-21

湖北省教育廳科學研究計劃重點項目(D20152012)

菅志遠(1975-)，男，河南襄城人，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，研究方向：消化道腫瘤基礎和臨床研究。

R735.3

A