王朝陽，李炳輝，鄭忠立，孟繼明，任學(xué)群,3

1. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普外科，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 循證醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000； 3. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000

JMJD1A通過調(diào)節(jié)c-Myc的表達影響胃癌細胞的增殖及侵襲

王朝陽1,2，李炳輝1，鄭忠立1，孟繼明1，任學(xué)群1,2,3

1. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普外科，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 循證醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000； 3. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000

〔目的〕探討JMJD1A調(diào)節(jié)c-Myc的表達變化對胃癌細胞增殖及侵襲的影響。〔方法〕使用QRT-PCR和Western blot實驗檢測JMJD1A、c-Myc基因表達，CCK8用于檢測轉(zhuǎn)染后細胞的增殖能力，Transwell實驗及劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞的侵襲及遷移能力?！步Y(jié)果〕JMJD1A高表達并且可調(diào)控c-Myc的表達，對c-Myc的表達呈正調(diào)控。在JMJD1A的表達受到干擾后，胃癌細胞的增殖能力明顯下降，侵襲和遷移能力明顯降低?！步Y(jié)論〕JMJD1A能夠通過調(diào)控c-Myc表達促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。

JMJD1A; c-Myc; 胃癌；侵襲；細胞增殖

胃癌是世界上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。我國胃癌發(fā)病率很高，其死亡率占世界所有胃癌死亡率的一半，高于發(fā)達國家[1-2]。其發(fā)生可能與飲食習(xí)慣、幽門螺旋桿菌感染、遺傳等因素有關(guān)，且發(fā)病率隨年齡增長而增高[3]。組蛋白去甲基化酶JMJD1A(Jumonji domain containing 1A)通過羥基化作用使組蛋白賴氨酸去甲基化在細胞生長、組織發(fā)育和器官行程中起作用[4-5]。有研究表明，JMJD1A表達的變化與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，但在胃癌中的作用及調(diào)節(jié)機制尚不清楚。本研究以胃癌細胞系為材料，檢測JMJD1A在胃癌細胞的表達和調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

胃癌細胞株HGC-27和MKN-45均購于中科院上海細胞生物所；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR Green I試劑均購于上海閃晶分子生物科技有限公司；Western-blot抗體購于美國Santa Cruz公司；CCK-8試劑和Transwell購于Sigma公司；LV3-si-JMJD1A和LV3-NC購于GenePharma公司。

1.2 細胞株培養(yǎng)

人胃癌細胞系HGC-27和MKN-45用體積分數(shù)為10%的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并加入青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/L)，置于37 ℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待生長到對數(shù)期時備用。

1.3 JMJD1A干擾載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

首先構(gòu)建JMJD1A干擾病毒載體LV3-si-JMJD1A及空白對照LV3-NC。將復(fù)蘇的HGC-27和MKN-45細胞接種于6孔板中(密度為2×105個/孔)，每孔3 mL。待細胞貼壁后更換新的不含雙抗而含體積分數(shù)為5%的FBS培養(yǎng)基2 mL，然后進行轉(zhuǎn)染。HGC-27、MKN-45細胞MOI值為1，結(jié)合病毒滴度加入病毒液，輕輕混勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；過夜后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，拍照觀察。

1.4 QRT-PCR和Western blot實驗

按照TRIzol說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后應(yīng)用FTC 2000進行熒光定量PCR分析。采用2-ΔΔCt方法分析mRNA的表達，其中β-actin作為內(nèi)參。將細胞裂解提取總蛋白，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，之后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用體積分數(shù)為5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，再用體積分數(shù)為1%的脫脂牛奶稀釋孵育一抗4 ℃過夜(1∶500)，稀釋孵育二抗37 ℃ 1 h(1∶1 000)，暗室顯影。

1.5 細胞增殖能力檢測

取正常培養(yǎng)的HGC-27和MKN-45細胞及轉(zhuǎn)染72 h后的HGC-27和MKN-45細胞，觀察細胞狀態(tài)。細胞鋪板，對數(shù)生長期的細胞用胰蛋白酶消化成單個細胞，接種于96孔板中，鋪5板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每種細胞分為3組：未轉(zhuǎn)染的空白對照組、轉(zhuǎn)染空載體的NC組及轉(zhuǎn)染JMJD1A慢病毒組。分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，每孔加入10 μL CCK8溶液(5 g/L)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標儀在450 nm測出各孔吸光值，記錄不同時間點的實驗數(shù)據(jù)。

1.6 細胞Transwell實驗

用胰蛋白酶消化細胞，細胞計數(shù)5×104，接種于6孔Transwell小室，小室中鋪500 μL細胞，板孔中加入3 mL完全培養(yǎng)基。每種細胞分3組：未轉(zhuǎn)染的空白對照組、轉(zhuǎn)染空載體的NC組及轉(zhuǎn)染JMJD1A慢病毒組。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，小室用1×PBS洗2次。用刀片把小室穿透膜取下來放在載玻片上(把有透過細胞的那面朝上放，便于染色)，然后把貼有小室穿透膜的載玻片用體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次(5 min/次)。用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的Trition X-100透化細胞15 min，1×PBS洗3次，加100 μL蘇木素染色20 min。自來水洗2 min，再用新的自來水浸泡10 min反藍，用中性樹膠封片，鏡檢。

1.7 細胞劃痕實驗

正常培養(yǎng)的HGC-27和MKN-45細胞及轉(zhuǎn)染72 h后的HGC-27和MKN-45細胞，長滿培養(yǎng)板底部。用200 μL tip頭劃痕，用PBS洗至培養(yǎng)基內(nèi)無漂浮的細胞。鏡下觀察拍照劃痕的部位，并做好標記。并在0、36、48 h時觀察拍照。

1.8 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)值用mean±SD表示，組間比較采用t檢驗或非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建及病毒包裝

病毒LV3-si-JMJD1A的滴度約為4×108TU/mL，LV3-NC的滴度約為3×108TU/mL。病毒滴度較高，可以用于后續(xù)的浸染胃癌細胞。

2.2 轉(zhuǎn)染干擾JMJD1A載體后基因mRNA及蛋白的表達

在HGC-27和MKN-45細胞中，JMJD1A均高表達，并且c-Myc的表達與JMJD1A的表達呈正相關(guān)。在胃癌細胞株中，干擾JMJD1A的表達后，c-Myc的表達也明顯下降(P<0.05)。見圖1。

Westernblot結(jié)果顯示，在兩組細胞系中，c-Myc的蛋白表達與JMJD1A的蛋白表達量呈正相關(guān)，與圖1的結(jié)果相似。見圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染干擾JMJD1A載體后基因mRNA的表達

圖2 轉(zhuǎn)染干擾JMJD1A載體后蛋白的表達

2.3 細胞增殖能力檢測結(jié)果

圖3 3組細胞的增殖能力比較

圖3顯示了3組細胞的增殖能力。從圖中可以得出，在HGC-27和MKN-45細胞中，轉(zhuǎn)染干擾載體組與陰性對照及空白對照組相比，細胞的增殖能力均明顯下降(P<0.05)。即干擾JMJD1A的表達后，胃癌細胞增值能力降低。

2.4 細胞Transwell實驗結(jié)果

圖4、圖5表明，無論是在HGC-27細胞中，還是在MKN-45細胞中，干擾JMJD1A的表達后，胃癌細胞的侵襲能力都明顯下降(P<0.05)。

圖4 3組細胞電鏡下的染色圖片

圖5 3組細胞侵襲能力的比較

2.5 細胞劃痕實驗結(jié)果

細胞劃痕實驗結(jié)果表明，干擾JMJD1A的表達后，HGC-27和MKN-45細胞的遷徙能力均明顯下降，見圖6、圖7。P<0.05。

圖6 電鏡下胃癌細胞的遷徙能力

圖7 3組細胞中劃痕愈合實驗結(jié)果

3 討論

胃癌是一種多因素影響，發(fā)病機制復(fù)雜的惡性腫瘤，常規(guī)的治療手段主要是手術(shù)、化療和放療，但經(jīng)常出現(xiàn)復(fù)發(fā)、腹腔轉(zhuǎn)移。腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移是影響患者生存質(zhì)量的主要原因，因此，早期診斷是提高胃癌生存期的重要手段。癌基因的激活與抑癌基因的失活導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，JMJD1A的異常表達在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與遷移中起著重要作用并有可能作為治療的重要分子靶點。JMJD1A在多種腫瘤中高表達，比如肝癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等。Yamada等[6]發(fā)現(xiàn)，JMJD1A在肝癌組織中高表達，在缺氧條件下抑制JMJD1A表達可降低細胞生長，降低侵襲能力并阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)。Fan等[7]的研究顯示，JMJD1A在轉(zhuǎn)錄和翻譯上通過調(diào)節(jié)c-Myc基因的表達對前列腺癌細胞的生存和增殖起關(guān)鍵作用。Zhan等[8]發(fā)現(xiàn)，JMJD1A能促進非小細胞肺癌的發(fā)生，JMJD1A/EZH2/Let-7c可構(gòu)成一個反饋回路，有可能成為非小細胞肺癌的治療手段。

本次實驗為探討JMJD1A在腫瘤發(fā)生的作用，通過RNA干擾技術(shù)對胃癌細胞系HGC-27和MKN-45中JMJD1A和c-Myc的表達進行檢測，并且研究了通過JMJD1A調(diào)控c-Myc，對胃癌細胞增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，在胃癌細胞中，JMJD1A高表達并且可調(diào)控c-Myc的表達，對c-Myc的表達呈正調(diào)控。當干擾JMJD1A的表達后，c-Myc的表達明顯下降。進一步研究顯示，在JMJD1A的表達受到干擾后，胃癌細胞的增殖能力明顯下降，侵襲能力明顯降低。由結(jié)果中可以得出，在胃癌細胞中JMJD1A的表達可調(diào)控c-Myc的表達，并呈正相關(guān)。另外，JMJD1A在胃癌細胞中可促進胃癌細胞的增殖和侵襲。

總之，JMJD1A通過調(diào)控c-Myc的表達對胃癌細胞的生長及侵襲的調(diào)節(jié)起重要作用。

[1]TrongVE,WuAW,SelbyLV,etal.DifferencesingastriccancersurvivalbetweentheU.S.andChina[J].JSurgOncol, 2015, 112(1):31-37.

[2]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina, 2015 [J].CACancerJClin, 2016, 66(2):115-132.

[3]WuMS,ChenCJ,LinJT.Host-environmentinteractions:theirimpactonprogressionfromgastricinflammationtocarcinogenesisandondevelopmentofnewapproachestopreventandtreatgastriccancer[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev, 2005, 14(8):1878-1882.

[4]TsukadaY,FangJ,Erdjument-BromageH,etal.HistonedemethylationbyafamilyofJmjCdomain-containingproteins[J].Nature, 2006, 439(7078):811-816.

[5]TeeAE,LingD,NelsonC,etal.ThehistonedemethylaseJMJD1Ainducescellmigrationandinvasionbyup-regulatingtheexpressionofthelongnoncodingRNAMALAT1 [J].Oncotarget, 2014, 5(7):1793-1804.

[6]YamadaD,KobayashiS,YamamotoH,etal.Roleofthehypoxia-relatedgene,JMJD1A,inhepatocellularcarcinoma:clinicalimpactonrecurrenceafterhepaticresection[J].AnnSurgOncol, 2012, 19(Suppl3):S355-364.

[7]FanL,PengG,SahgalN,etal.Regulationofc-MycexpressionbythehistonedemethylaseJMJD1Aisessentialforprostatecancercellgrowthandsurvival[J].Oncogene, 2016, 35(19):2441-2452.

[8]ZhanM,WenF,LiuL,etal.JMJD1ApromotestumorigenesisandformsafeedbackloopwithEZH2/let-7cinNSCLCcells[J].TumourBiol, 2016, 37(8):11237-11247.

[責任編輯 時 紅]

Regulation of c-Myc Expression by the Histone Demethylase JMJD1A is Essntial for Gastric Cancer Cell Growth and Invasion

WANG Chaoyang1,2, LI Binghui1, ZHENG Zhongli1, MENG Jiming1, REN Xuequn1,2,3■

1. Department of Surgery, Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, China; 2. Center for Evidence-Based Medicine, Henan University, Kaifeng 475000, China; 3. Center for Translational Medicine, Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, China

〔Objective〕In this study, we aimed to explore the effects of JMJD1A on the proliferation and invasion of gastric cancer by regulating c Myc expression. 〔Methods〕 ORT PCR and Western blot were used to detect the expression of JMJD1A and c-Myc. The cell proliferation ability was detected with CCK8 methods. And Transwell analysis and Wound Healing were used to explore the abilities of invasion and migration, respectively. 〔Results〕JMJD1A was upregulated in gastric cancer cells and could regulated the expression of c Myc. The expression of c-Myc was positive correlation with JMJD1A. After interfered the expression of JMJD1A, the cell proliferation ability, invasion ability and migration ability were all decrease in the gastric cancer cells. 〔Conclusion〕Our findings identified a critical role for JMJD1A in regulating proliferation and invasion of gastric cancer cells by controlling c Myc expression.

JMJD1A; c-Myc; gastric cancer; invasion; cell growth

1672-7606(2017)02-0119-04

2017-02-21

開封市科技發(fā)展計劃項目(1407008)

王朝陽(1987-)，男，河南臨潁人，醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤及循證外科學(xué)研究。

■通信作者：任學(xué)群(1964-)，男，河南正陽人，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤研究及醫(yī)學(xué)教育管理。E-mail：renxuequn001@163.com。

R735.2

A