陳紅 徐菊美 趙世成 岑蓮

負(fù)載納米磁鐵顆粒的PLGA微球的可控制備研究

陳紅 徐菊美 趙世成 岑蓮

目的采用微流控法制備聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球，并同時負(fù)載納米磁鐵顆粒，為利用PLGA復(fù)合微球?qū)崿F(xiàn)靶向給藥，以及應(yīng)用MRI進行追蹤提供實驗基礎(chǔ)。方法設(shè)計微流控三相裝置，用微流控法制備得到PLGAFe3O4復(fù)合微球，并對所得微球的形貌及Fe3O4納米磁鐵顆粒在微球內(nèi)部的分布情況進行分析測試。結(jié)果微流控法制備的PLGA-Fe3O4復(fù)合微球粒徑均一，形貌和分散性好。元素分析結(jié)果證實了Fe元素的存在。TEM觀察表明，F(xiàn)e3O4納米磁鐵顆粒在微球內(nèi)部以納米尺徑存在，且分散良好，未出現(xiàn)團聚現(xiàn)象。結(jié)論證實了利用微流控法制備負(fù)載納米磁鐵顆粒PLGA微球的可行性，為PLGA微球提供了進一步功能化以及靶向給藥和MRI追蹤的可能性。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球納米磁鐵顆粒微流控法

近年來，生物可降解材料的研究備受重視，其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）具有生物相容性好、可生物降解且降解產(chǎn)物安全無毒、降解速度可控等優(yōu)點。PLGA載藥微球因其載體材料PLGA自身的降解性能，最終可實現(xiàn)微球所包埋藥物在體內(nèi)的可控釋放，且釋放周期相對較長，釋放緩慢，有效避免了頻繁大劑量給藥造成的高藥物濃度對人體的毒副作用，減輕了患者的痛苦與不便，且明顯減少了給藥量，提高了藥物的利用率[1-2]。另外，PLGA載藥微球可通過在治療部位局部給藥，使得藥物直接在治療處局部控釋，保持長期有效的藥物濃度[3-4]。

根據(jù)釋放的需要，選擇合適的方法在PLGA微球上負(fù)載納米磁性物質(zhì)，可使PLGA微球具有一定的磁性功能，有利于載藥微球的靶向治療和治療后MRI追蹤。其中應(yīng)用最多的是Fe3O4納米磁鐵顆粒，該顆粒具有特殊的磁性功能、良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，是一種可廣泛應(yīng)用在靶向控釋藥物、細(xì)胞分離及磁熱療等領(lǐng)域的理想材料。本研究利用微流控法制備了負(fù)載Fe3O4納米磁鐵顆粒的PLGA微球，使制備過程可控，并對其性能進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

PLGA（100 g PDLG 5010，荷蘭Corbion Purac公司）；聚乙烯醇（PVA，美國Sigma公司）；二氯甲烷（分析純試劑，國藥集團）；Fe3O4納米磁鐵顆粒溶液（5 mg/mL in H2O，美國Sigma公司）。

1.2 微流控法制備PLGA-Fe3O4微球

1．2．1微流控裝置的設(shè)計及制備

采用玻璃毛細(xì)管制備微流控裝置微通道。首先，將玻璃方形管（2～3 cm）固定到載玻片上；再將圓形玻璃毛細(xì)管用拉管儀制成兩段，拉制結(jié)束的毛細(xì)管均有一端直徑為10 μm的錐形口，然后用砂紙將其中一個錐形口磨成管口直徑（Do）為100 μm左右，另一個磨成前一個管徑大小的2～3倍。錐形管口確保磨平，并吹凈。將磨好吹凈的毛細(xì)管分別從已固定好的方形管左右兩端插入，兩管管口距離約為較小的管口直徑的一半（約50 μm），各管水平中心線對齊后固定。將三個針頭塑料端兩側(cè)均切出兩個凹槽，使其恰好可以嵌入方形管和圓管的入口端，最后用膠水固定針頭，凝固后即可得裝置（圖1）。

圖1 微通道顯微鏡圖及微流控三相裝置圖Fig.1Microscopic image of inner mircochannels and photographic image of the glass capillary device of three fluid channels

1．2．2PLGA-Fe3O4微球的制備

分別配制PVA和Fe3O4納米磁鐵顆?；旌纤芤海▋?nèi)水相，Qi），其中PVA濃度為1 wt%，F(xiàn)e3O4納米磁鐵顆粒為1 mg/mL；2 wt%PVA水溶液（外水相，Qo）和0.6 wt%PLGA溶液（油相，Qm）分別用注射器吸取后，固定于3臺微量注射泵上，并連接到相對應(yīng)的裝置上。其中，內(nèi)水相和油相溶液同向流入微流控裝置，而外水相溶液反方向流入通道內(nèi)。設(shè)置微量注射泵參數(shù)，即Qi、Qm、Qo，分別為1 mL/h、2 mL/h、4 mL/h。排氣后，啟動微量注射泵，即可在通道內(nèi)形成W/O/W型微球液滴，配制0.5 wt%PVA水溶液收集微球。收集完畢后，250 r/min磁力攪拌24 h，以揮發(fā)溶劑。然后通過反復(fù)離心（5 000 r/min）和蒸餾水清洗（3次），除去殘留PVA后，冷凍干燥即得PLGA-Fe3O4微球。

1.3 檢測方法

1.3.1 光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡

取少量微球于載玻片上，放在顯微鏡載物臺上，用顯微鏡觀察PLGA-Fe3O4微球的形貌及分散情況。將冷凍干燥所得的PLGA-Fe3O4微球樣品適量固定于掃描電鏡托的導(dǎo)電膠上，噴金處理后，SEM觀察微球形貌。

1.3.2 能譜分析

用能譜儀（Energy dispersive spectrometer，EDS）配合SEM對微流控法制備的PLGA-Fe3O4微球進行元素定性分析。EDS主要是用來檢測PLGA-Fe3O4微球中Fe元素存在及分布情況。

1.3.3 透射電鏡

由于Fe3O4納米磁鐵顆粒在微球中的分散情況對其性能有很大的影響，因此進一步通過透射電鏡（Transmission electron microscope，TEM）來觀察微球內(nèi)磁鐵顆粒的分布。考慮到透射電鏡的電子束穿透力有限，無法直接用于幾十微米微球的觀察。因此在TEM觀察之前需要對微球進行超薄切片處理，微球用樹脂包埋后用超薄切片機將已包埋的樣品切成數(shù)十納米厚的超薄切片，之后再進行TEM觀察。

2 結(jié)果

2.1 PLGA-Fe3O4微球的形貌分析

首先通過光學(xué)顯微鏡觀察所得微球的分散性，結(jié)果可見微流控法制備的PLGA-Fe3O4微球大小均勻，分散性好，顆粒間無黏連現(xiàn)象，球形圓整度極好（圖2）。

圖2 微流控法制備的PLGA微球光學(xué)顯微鏡觀察Fig.2Optical microscopy images of PLGA microspheres prepared by microfluidics

SEM觀察微流控法制備的PLGA-Fe3O4微球表面形貌，可見PLGA-Fe3O4微球粒徑均一，分散性好，表面致密無孔，球形形貌好（圖3）。

圖3 微流控三相裝置制備的PLGA-Fe3O4微球的SEM觀察Fig.3SEM images of PLGA-Fe3O4microspheres prepared by microfluidics of three channels

通過對微球進行粒徑統(tǒng)計分析可得，微球的平均粒徑（Dp）為62.41 μm，粒徑在51.16～69.77 μm范圍內(nèi)。其中，粒徑在56.98～67.44 μm的微球占總數(shù)的98.2%，59.30～67.44 μm粒徑的占94%，59.30～ 65.12 μm粒徑的占89.4%。根據(jù)數(shù)據(jù)計算得到的PLGA微球的離散系數(shù)（CV）為1.93%，說明該方法制得的微球粒徑的離散程度很小，粒徑分布均勻。

2.2 元素分析

實驗所用Fe3O4納米磁鐵顆粒為水性溶液，與內(nèi)水相溶液混合后一起作為微流控裝置的內(nèi)水相，最終獲得PLGA-Fe3O4微球。為了研究納米磁鐵顆粒的分布情況，實驗通過EDS配合SEM對微球進行元素定性分析。首先，用EDS對復(fù)合微球中C元素、O元素及Fe元素進行分析，結(jié)果顯示三種元素的計數(shù)點分布圖（圖4D-F）與微球掃描圖（圖4B）相對應(yīng)，能較清楚地看到掃描范圍內(nèi)元素計數(shù)點構(gòu)成的球形形狀，可以初步判斷出納米磁鐵顆粒在復(fù)合微球中分布比較均勻。通過比較C、O、Fe三種元素（圖4D-F），可以觀察到Fe元素在微球內(nèi)部的集中分布區(qū)域略小于C元素和O元素，如圖中圓形虛線區(qū)域；與C元素和O元素相比，F(xiàn)e元素分布比C元素和O元素約小了厚度為5.13 μm的外層區(qū)域（圖4D-F）。根據(jù)微流控裝置的設(shè)置及三相流體的分布情況，我們推測存在此現(xiàn)象可能與微球結(jié)構(gòu)有關(guān)，且此層厚度與微球外層PLGA結(jié)構(gòu)的厚度相對應(yīng)。此外，根據(jù)能量與計數(shù)的關(guān)系圖（圖4C），明確了納米磁鐵顆粒在PLGA微球中的存在。

2.3 Fe3O4納米磁鐵顆粒的分散性分析

確定微球中Fe元素的存在后，進一步用TEM來觀察納米磁鐵顆粒在復(fù)合微球內(nèi)的分布情況。因微球粒徑較大，不利于TEM的電子束穿透，無法直接用TEM觀察。因此，對微球進行樹脂包埋后用超薄切片機將其切成幾十納米厚的薄片，行TEM觀察，并以PLGA微球的超薄切片作為對照。TEM觀察顯示，在PLGA-Fe3O4微球的超薄切片中分散著許多幾十納米大小的黑色顆粒，而在對照組中則沒有觀察到上述黑色顆粒（圖5 B1、B2中邊界線為樣品切片與包埋樹脂的界面），由此可以判斷該黑色顆粒為微球制備時加入的Fe3O4納米磁鐵顆粒。本實驗采用平均直徑為20 nm左右的納米磁鐵顆粒，從圖中黑色部分的大小及分散情況可以看出，納米磁鐵顆粒仍為100 nm以內(nèi)粒徑分布，且分布情況良好，并未出現(xiàn)大塊的顆粒團聚，可以認(rèn)為包裹在PLGA微球內(nèi)的納米磁鐵顆粒的性能和作用并未受制備過程影響，從而為今后功能化PLGA微球的制備，以及靶向給藥和MRI追蹤提供了可能。

圖4 PLGA-Fe3O4微球的元素分析能譜圖Fig.4Elemental analysis images of PLGA-Fe3O4microspheres by EDS

圖5 PLGA-Fe3O4微球和PLGA微球超薄切片的TEM觀察Fig.5TEM images of ultrathin cross sections of PLGAFe3O4and PLGA microspheres

3 討論

PLGA微球生物性能良好，常被用作藥物緩釋載體材料，其性能與微球的形貌、粒徑分布、分散性、結(jié)構(gòu)等性能有密切關(guān)系。本研究利用微流控法制備了PLGA微球，對其形貌進行分析，結(jié)果顯示微流控法制備的微球粒徑均一，形貌特征良好，分散性極好。

PLGA微球的制備主要有乳化/溶劑揮發(fā)法、噴霧干燥法、超臨界CO2法等，不同的方法會導(dǎo)致載藥微球的性能差異，包括形貌、結(jié)構(gòu)、載藥性能和藥物釋放性能等，所以對微球制備方法的選擇和優(yōu)化至關(guān)重要。乳化/溶劑揮發(fā)法是最常用的制備方法，該方法制備的PLGA微球粒徑分布廣，微球粒徑不均勻，偶然性大，且各微球間存在黏連現(xiàn)象。噴霧干燥法制備PLGA載藥微球時，先將需要包埋的藥物制備成乳濁液，再將其通入噴霧干燥器，利用霧化器將混合物霧化分散，形成小液滴，最后噴入熱空氣流，使液滴迅速干燥、硬化，而得到PLGA微球，但這種微球分散性差，顆粒間黏連明顯。乳濁液霧化分散成液滴的過程不易控制，導(dǎo)致微球粒徑分布廣，微球不均勻。超臨界CO2法是將超臨界CO2作為抗溶劑，使其與PLGA溶液充分接觸后，在溶液中迅速擴散，并吸收其中的有機溶劑，使得溶液迅速膨脹，而溶液中溶劑對溶質(zhì)的溶解能力下降，繼而溶液過飽和，溶質(zhì)PLGA析出，從而得到PLGA微球，該方法過程不易控制，微球的形貌特征差，球形圓整度低，團聚現(xiàn)象嚴(yán)重，顆粒間存在黏連，且粒徑分布廣。微流控技術(shù)制備PLGA微球，并負(fù)載納米磁鐵顆粒，所得微球粒徑均一，可實現(xiàn)微球尺寸上的高度單分散，無黏連現(xiàn)象，且可獲得分散性極好的納米磁鐵顆粒的功能化。因此，本研究從方法學(xué)上克服了上述傳統(tǒng)方法的缺點。微流控法是近年來發(fā)展的一種操控微體積液體的新技術(shù)[5]，其基本原理是在微米尺度內(nèi)的微通道里，互不相容的流體經(jīng)過流動的剪切力和流體表面張力的相互作用，最終被分割成離散的微米級乳液液滴。微流控技術(shù)可以連續(xù)、可控地制備出高度單分散的微液滴，并能對微液滴結(jié)構(gòu)進行精確調(diào)控，包括乳液液滴的尺寸、組分、內(nèi)外液層的厚度等[6-8]。

Liu等[9]用乳化法制備了PLGA-Fe3O4納米顆粒，結(jié)果表明此納米顆粒在體內(nèi)安全無毒，并能作為檢測血栓的磁共振造影劑。Hajikarimi等[10]用PLGA負(fù)載納米磁鐵顆粒，證明負(fù)載在該納米顆粒上的藥物可以更為有效地將5-FU遞送至細(xì)胞內(nèi)。PLGA微球復(fù)合納米磁鐵顆粒后，不僅具有PLGA特性，還兼有納米磁鐵顆粒特性，即此時的PLGA在外加磁場下能表現(xiàn)出一定的磁響應(yīng)性。所以，磁性PLGA微球在生物工程、醫(yī)學(xué)及細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域中被廣泛地用作酶、藥物及細(xì)胞等的載體，其作用主要是利用納米顆粒的性能，使PLGA微球具有磁靶向藥物、醫(yī)學(xué)檢測診斷、基因治療、細(xì)胞分離和免疫分析以及吸附和固定化蛋白酶等功能。PLGA微球作為藥物控釋載體材料已被廣泛應(yīng)用于化療劑、多糖、抗生素等藥物的控釋方面，其中作為對治療腫瘤、癌癥的藥物的包埋材料已成為研究熱點。因此，本研究用微流控法制備了PLGA-Fe3O4微球，并對納米磁鐵顆粒在微球內(nèi)部的分散情況進行了分析研究，可以確定Fe元素的存在，證實了用微流控法在內(nèi)水相負(fù)載Fe3O4納米磁鐵顆粒的可能性。此外，TEM觀察表明，F(xiàn)e3O4納米磁鐵顆粒在微球內(nèi)部的分散性良好，未出現(xiàn)大塊的團聚現(xiàn)象，說明本方法對納米磁鐵顆粒的負(fù)載過程和磁鐵顆粒的分散性質(zhì)未產(chǎn)生影響，提供了PLGA微球進一步功能化以及靶向給藥和MRI追蹤的可能性。

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Preparation and Characterization of Fe3O4Magnetic Nanopaticles Loaded PLGA Microspheres

CHEN Hong,XU Jumei,ZHAO Shicheng,CEN Lian.
School of Chemical Engineering,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237,China.Corresponding author:CEN Lian(E-mail:cenlian@hotmail.com).

ObjectiveTo prepare Fe3O4magnetic nanopaticles loaded poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)microspheres using microfluidics,and to characterize this microspheres for future possible applications as targeted drug delivery and MRI tracking.MethodsPLGA-Fe3O4microspheres were prepared by three-phase microfluidic devices.Morphology of microspheres and distribution of Fe3O4magnetic nanopaticles inside PLGA microspheres were analyzed.ResultsThe PLGA-Fe3O4microspheres prepared by microfluidic method had uniform particle size distribution and excellent dispersibility. The results of elemental analysis confirmed the presence of Fe,and the results of TEM observation showed that Fe3O4magnetic nanopaticles were well dispersed inside the microspheres without agglomeration.ConclusionThe feasibility of Fe3O4magnetic nanopaticles loaded PLGA microspheres prepared by microfluidic method is demonstrated.The current study thus provides possibility of using PLGA microspheres for targeted drug delivery and MRI tracking.

PLGA microspheres;Fe3O4magnetic nanopaticles;Microfluidics

R318.08

A

1673－0364（2017）03－0127－04

2017年3月7日；

2017年4月16日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.03.003

200237上海市華東理工大學(xué)化工學(xué)院。

岑蓮（E-mail：cenlian@hotmail.com）。