王濟(jì)舟，曾 宇，宋 燁，漆松濤

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515

基礎(chǔ)研究

傳代次數(shù)對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響

王濟(jì)舟，曾 宇，宋 燁，漆松濤

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515

目的探索不同傳代次數(shù)對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響及其分子機(jī)制。方法以兩種不同傳代次數(shù)的U87（I）、U87（II）為研究對(duì)象，使用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)及Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；使用Western Blot技術(shù)檢測(cè)U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）的CTHRC1, FOXM1, PLOD2, MMP9, TGF-β, E-cadherin,Slug, Snail, Vimentin, PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt的表達(dá)量差異。結(jié)果U87（Ⅰ）較U87（Ⅱ）更容易形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有更強(qiáng)的侵襲能力，但在增殖和遷移能力上二者無明顯差異。在EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平上，U87（Ⅰ）中的Snail、Vimentin的表達(dá)量較U87（Ⅱ）的高，而E-Cadherin、Slug則較低；在PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)水平上，U87（Ⅰ）的p-Akt，Akt的表達(dá)量均低于U87（II），而p-PI3K的表達(dá)量卻高于U87（II），兩者在PI3K的表達(dá)量上無明顯差異；除此之外，U87（I）中PLOD2、CTHRC1及MMP9的表達(dá)量也明顯高于U87（II），而TGF-β的表達(dá)量則低于后者。結(jié)論隨著傳代次數(shù)的增加，U87細(xì)胞在侵襲能力以及多個(gè)促癌基因表達(dá)上發(fā)生了變化，這可能造成分子機(jī)制研究的前后結(jié)果不一致，降低結(jié)果的可信程度，因此研究人員在進(jìn)行細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)盡可能在短時(shí)間內(nèi)，使用同一批次細(xì)胞完成生物學(xué)特性、分子機(jī)制研究，以減少傳代次數(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性以及基因表達(dá)的影響。

膠質(zhì)瘤；U87；傳代次數(shù)；侵襲能力

穩(wěn)定的腫瘤細(xì)胞系是如今科學(xué)研究人員進(jìn)行腫瘤研究的重要工具[1-5]，細(xì)胞系的永生特性使得研究者可以不斷的深入探索該細(xì)胞系所代表的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，從而為腫瘤的診斷、治療及預(yù)后找到新的突破口。然而實(shí)驗(yàn)者在操作細(xì)胞時(shí)極為容易將細(xì)胞弄混，許多研究者便因混淆細(xì)胞系而遭遇撤稿[6-7]。此外，Lin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同代數(shù)的前列腺癌細(xì)胞之間存在異質(zhì)性，說明在不斷的傳代過程中，細(xì)胞的生物學(xué)特性及基因表達(dá)都有可能出現(xiàn)變化。人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系建立于1966年，是由瑞典烏普薩拉大學(xué)的研究人員利用一位44歲的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤女患者的組織進(jìn)行培養(yǎng)得到的，現(xiàn)已是全球各地研究人員研究膠質(zhì)瘤的最常用的細(xì)胞系之一[9]。這個(gè)細(xì)胞系的廣泛使用為廣大研究人員提供了便利，但現(xiàn)有研究中卻鮮有研究者研究不同傳代次數(shù)的U87細(xì)胞的異同，以及明確述及他們的實(shí)驗(yàn)是否是在相同傳代次數(shù)的U87細(xì)胞中進(jìn)行，故而這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性都是值得推敲的。本實(shí)驗(yàn)旨在探索不同傳代次數(shù)U87細(xì)胞的分子表型及生物學(xué)功能差異，以明確在相同傳代次數(shù)的U87細(xì)胞中進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的必要性。

1 方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。U87細(xì)胞采用10%胎牛血清（Gemini）的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 Western blot

Western blot的操作流程及具體方法[10], 本實(shí)驗(yàn)中使用的抗體包括anti-CTHRC1, FOXM1, PLOD2,MMP9, TGF-β, E-cadherin, Slug, Snail, Vimentin,PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt, β-actin, GAPDH。具體的抗體見補(bǔ)充表格。所有圖片均為Bio-Rad公司的化學(xué)發(fā)光儀拍攝獲得，并使用Image-Pro Plus 6.0測(cè)量所獲條帶灰度值。

1.3 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)使用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力[11]。將U87細(xì)胞鋪于96孔板的孔中（1000個(gè)/孔，200 μL/孔），每種細(xì)胞均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后加入20 μL MTT（5 mg/mL稀釋于PBS中, Sigma, St Louis, MO），4 h后吸出培養(yǎng)基，使用150 μLDMSO（Sigma, St Louis,MO）溶解甲瓚結(jié)晶，并用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm的吸光度。此后每天同一時(shí)間加入MTT及測(cè)量吸光度，共觀察7 d。

1.4 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)方法同我們此前發(fā)表文章中所述[12]。對(duì)于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，我們將1×105細(xì)胞用100 μL無血清培養(yǎng)基重懸，鋪入小室中，2 h 30 min后使用甲醇固定，并用Giemsa染色液染色。對(duì)于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，我們首先在小室中鋪入100 μL的基質(zhì)膠（康寧）（250 μg/mL），在37 ℃、5% CO2孵箱中靜置4 h后再鋪入細(xì)胞，具體步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)時(shí)選取200 x視野，在四個(gè)視野中計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)并取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)以及Western灰度值結(jié)果均采用非配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傳代次數(shù)不同的細(xì)胞的形態(tài)及生長特性不同

U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）為不同傳代次數(shù)的兩批細(xì)胞，其中U87（Ⅱ）的傳代次數(shù)較多，二者的傳代次數(shù)差異＞100代。將相同數(shù)量的U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）鋪入10 cm的培養(yǎng)皿中，7 h后于鏡下觀察二者的形態(tài)及密度，兩種細(xì)胞的密度無明顯差異，但U87（Ⅰ）的外觀較U87（Ⅱ）更加飽滿，體積稍大。4 d后再次觀察兩種細(xì)胞，外觀出現(xiàn)了明顯的差異。U87（Ⅰ）形成了明顯的較為規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀空隙較大，空隙中無貼壁細(xì)胞，U87（Ⅱ）雖然也形成了一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞的排列較為散亂，所形成的網(wǎng)狀空隙較?。▓D1）。

2.2 傳代次數(shù)不同的細(xì)胞的侵襲能力不同

圖1 U87（Ⅰ）與U87（Ⅱ）在鏡下的形態(tài)差異

為探究U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）的生物學(xué)特性的差異，我們進(jìn)行了MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)及Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)兩者的增殖、遷移、侵襲能力，3種實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)了3次，Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)及Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為4個(gè)不同視野的平均值。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，兩種細(xì)胞在增殖能力上無明顯差異（圖2）。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，U87（Ⅰ）的遷移能力較U87（Ⅱ）稍強(qiáng)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.1169）。而Boyden實(shí)驗(yàn)顯示U87（Ⅰ）較U87（Ⅱ）的侵襲能力更強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0403, 圖3）。

圖2 U87（Ⅰ）和U87（Ⅱ）之間增殖能力的差異

2.3 傳代次數(shù)不同的細(xì)胞的蛋白表達(dá)量存在差異

為進(jìn)一步研究U87（Ⅰ）及U87（Ⅱ）出現(xiàn)侵襲能力差異的分子機(jī)制，本研究使用Western blot分析兩種細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白、PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白及部分促癌基因的蛋白的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，在EMT相關(guān)的蛋白表達(dá)量上，E-ca及Slug在U87（Ⅰ）中表達(dá)量較低，而Snail、Vimentin在U87（Ⅰ）中表達(dá)量較高；在PI3K/Akt通路上，Akt及p-Akt在87（Ⅰ）的表達(dá)量均低于U87（Ⅱ），但p-PI3K的表達(dá)量卻高于后者，而PI3K的表達(dá)量在兩個(gè)細(xì)胞系之間無明顯差異。此外，U87（Ⅰ）的MMP9、CTHRC1、PLOD2表達(dá)量明顯高于U87（Ⅱ），而TGF-β的表達(dá)量則較U87（Ⅱ）的低，F(xiàn)OXM1的表達(dá)量無明顯差異（圖4）。

3 討論

U87是目前膠質(zhì)瘤研究常用的穩(wěn)定細(xì)胞系，然而本研究團(tuán)隊(duì)在培養(yǎng)U87細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)及生長特性隨傳代次數(shù)的增加發(fā)生了變化，傳代次數(shù)較少的U87比較飽滿，細(xì)胞較大，易于結(jié)網(wǎng)，在傳代3～4 d后出現(xiàn)明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞會(huì)在網(wǎng)狀的骨架中增殖，而不會(huì)向骨架中的空隙中生長，而連續(xù)傳代半年后的U87細(xì)胞體積相對(duì)較小，不易結(jié)網(wǎng)。既往的研究表明，惡性程度高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系如U251、U87容易形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，F(xiàn)rancescone等[13]認(rèn)為這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)的微觀表現(xiàn)，是其高度惡性的表現(xiàn)之一。在此基礎(chǔ)上，本研究深入探究了形態(tài)相異的同種細(xì)胞系、不同傳代次數(shù)的細(xì)胞之間的生物學(xué)特性及蛋白表達(dá)差異。結(jié)果顯示，二者的生長和遷移能力無明顯差別，但傳代次數(shù)較少的U87的侵襲能力要強(qiáng)于傳代次數(shù)多的U87。而WB的結(jié)果則反映出二者在數(shù)個(gè)與腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)的基因在蛋白水平的表達(dá)量存在明顯的不同。本研究在前期研究中發(fā)現(xiàn)PLOD2及CTHRC1高表達(dá)可以促進(jìn)U87細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并且PLOD2在缺氧狀態(tài)下可促進(jìn)U87的生存。此外，MMP9為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員之一，許多研究證實(shí)MMP9可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤的遷移、侵襲能力[14-15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，傳代次數(shù)少的U87的PLOD2、CTHRC1及MMP9表達(dá)明顯高于傳代次數(shù)多的U87，這可能可以解釋為何前者較后者擁有更強(qiáng)的侵襲能力。

圖3 U87（Ⅰ）和U87（Ⅱ）之間遷移、侵襲能力的差異

圖4 U87（Ⅰ）和U87（Ⅱ）之間多種促癌基因表達(dá)量在蛋白水平上的差異

細(xì)胞系在傳代過程中可能出現(xiàn)不同細(xì)胞系交叉污染或者標(biāo)記錯(cuò)誤的情況，許多研究者因發(fā)現(xiàn)前期實(shí)驗(yàn)使用了錯(cuò)誤的細(xì)胞系而遭遇撤稿[6-7]。2016年Allen等[16]報(bào)道稱他們通過DNA指紋技術(shù)發(fā)現(xiàn)ATCC細(xì)胞庫所使用的U87與50年前建立的原始腫瘤樣本并不匹配。本實(shí)驗(yàn)僅使用了U87及U251兩種細(xì)胞系，從細(xì)胞形態(tài)可看出，U87（Ⅰ）與U87（Ⅱ）形態(tài)相近，且與U251形態(tài)明顯不同。為排除U87被U251污染的情況，研究對(duì)比了U251與U87（Ⅰ）之間部分蛋白表達(dá)量的差異。在PLOD2及CTHRC1的表達(dá)含量上，二者無顯著差異，故而可以推測(cè)，U87（Ⅰ）與U87（Ⅱ）所出現(xiàn)的蛋白表達(dá)含量差異并不是U251污染所致，而更可能是傳代過程中出現(xiàn)的基因突變、表觀遺傳學(xué)修飾等因素所致。

不同傳代次數(shù)影響細(xì)胞的遷移、侵襲能力，同時(shí)改變了癌基因或抑癌基因的表達(dá)，這可能有兩方面原因，一方面細(xì)胞本身存在異質(zhì)性，通過優(yōu)勝劣汰逐漸改變細(xì)胞的整體特性，另一方面，在培養(yǎng)過程中，不斷有外界的刺激或者干擾，如支原體污染，更換血清品牌，消化傳代等物理、化學(xué)因素，而對(duì)細(xì)胞的基因表達(dá)產(chǎn)生影響，繼而出現(xiàn)突變。在實(shí)驗(yàn)操作中，采用液氮凍存的方法保種，在培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)污染、凋亡或者用盡后，往往采取復(fù)蘇細(xì)胞，重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而這樣的操作可能因不同批次的細(xì)胞之間的差異，造成前后實(shí)驗(yàn)結(jié)果不相符，增加數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性。因此，研究人員在使用腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過程中，應(yīng)該盡量保證使用同一批細(xì)胞，并且在短時(shí)間內(nèi)完成分子機(jī)制、功能的相關(guān)研究，減少因傳代次數(shù)造成的細(xì)胞異質(zhì)性所帶來的影響。

此外，隨著傳代次數(shù)的增加及體外培養(yǎng)條件的改變，腫瘤細(xì)胞系的分子特性與其最初在體內(nèi)時(shí)有所差別，目前主流研究多用原位成瘤實(shí)驗(yàn)或者皮下成瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)M腫瘤在體內(nèi)的生物學(xué)過程[17-18]，但如果實(shí)驗(yàn)時(shí)腫瘤細(xì)胞系的分子特性已經(jīng)出現(xiàn)改變，成瘤實(shí)驗(yàn)并不能確切地反映出腫瘤在病人體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的真實(shí)情況。故而腫瘤研究應(yīng)不僅僅使用穩(wěn)定的細(xì)胞系，也應(yīng)重視原代細(xì)胞培養(yǎng)與使用。當(dāng)原代細(xì)胞能夠相對(duì)穩(wěn)定的傳代后，通過培養(yǎng)單克隆的原代細(xì)胞，建立新的傳代次數(shù)較少的細(xì)胞系，然后在該細(xì)胞系中驗(yàn)證分子機(jī)制，這樣可以盡可能地模擬腫瘤在病人體內(nèi)時(shí)的生物學(xué)特性，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信程度。

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Effect of different passage number on the biological characteristics of U87 glioblastoma cell line

WANG Jizhou, ZENG Yu, SONG Ye, QI Songtao
Department of Neurosurgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

ObjectiveTo unravel the differences of biological characteristics and the uderlying molecular mechanisms between different passages of U87 glioblastoma cell line.MethodsU87 (I) and U87 (II), with less or more passage number respectively,were established examined separately by MTT assay, transwell chamber assay, boyden chamber assay. Western blot was used to analyze the expression of CTHRC1, FOXM1, PLOD2, MMP9, TGF-β, E-cadherin, Slug, Snail, Vimentin, PI3K, p-PI3K, Akt and p-Akt separately in these two types of cells.ResultsCompared to U87 (II), U87 (I) was more prone to form tubules and showed more invasiveness, while there were no differences between U87 (I) and U87 (II) in proliferation and migration. The expression of markers of EMT varies in these two types of cells, with more expression of E-cadherin and Slug and less expression of Vimentin and Snail in U87 (II). Moreover, U87 (II) was found to have greater amount of Akt and p-Akt, but have smaller amount of p-PI3k. No significant difference was found on the expression of PI3K between these cells. Additionally, the expression of PLO2, CTHRC1 and MMP9 were higher in U87 (I) than that in U87 (II), while the expression of TGF-β in U87 (I)was lower than that in the latter one.ConclusionAs the passage number increased, U87 cell lines exhibited changes in invasiveness as well as some oncogenic genes’ expressions. It may lead to the different results during different periods, making the results inconvincible. Together, our results showed that, to lessen the influence of passage numbers on cells’ biological characteristics, scientists should use cells with same passage numbers and finish the experiments as quickly as they can.

glioma; U87; passage number; invasiveness

2017-02-06

國家自然科學(xué)基金（81502178）

王濟(jì)舟，博士研究生，E-mail： spiderpy@163.com；

漆松濤，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： qisongtaonfyy@126.com