尹桂麗+徐建寶+周燕燕

摘 要：微生物實(shí)驗(yàn)室中的菌種管理工作是一件非常重要的工作環(huán)節(jié)，對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響具有非常重要，為提高實(shí)驗(yàn)室的工作質(zhì)量、加強(qiáng)對(duì)微生物菌種的保管質(zhì)量，根據(jù)相關(guān)工作經(jīng)驗(yàn)和調(diào)查結(jié)果對(duì)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室菌種保存及管理模式進(jìn)行改進(jìn)，從而形成一個(gè)科學(xué)、規(guī)范、合理的微生物實(shí)驗(yàn)室菌種復(fù)蘇、傳代、保存體系是一件非常重要的事情，從而促進(jìn)我國(guó)微生物實(shí)驗(yàn)精確度提升，增強(qiáng)相關(guān)工程管理質(zhì)量的規(guī)范程度，為我國(guó)醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展及生產(chǎn)質(zhì)量提高創(chuàng)造良好的條件。

關(guān)鍵詞：菌種復(fù)蘇；傳代；保存

微生物實(shí)驗(yàn)是我國(guó)建筑醫(yī)藥研發(fā)及生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，是確保我國(guó)醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵基礎(chǔ)。根據(jù)藥典中的標(biāo)準(zhǔn)，微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)于新引進(jìn)的培養(yǎng)基需要通過靈敏度測(cè)試后才能投入使用；另外，在對(duì)無菌實(shí)驗(yàn)成果進(jìn)行檢查時(shí)需要使用金黃色葡萄球菌作為對(duì)比參照，而在對(duì)日常灌裝環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)時(shí)需要使用環(huán)境菌進(jìn)行輔助檢驗(yàn)。由此可見，菌種為微生物實(shí)驗(yàn)中非常關(guān)鍵的因素，所以必須要建立起一個(gè)科學(xué)、健全的微生物實(shí)驗(yàn)室菌種的復(fù)蘇、傳代及保存體系。

1 用具與設(shè)備

接種環(huán)，接種針，酒精燈，電熱恒溫培養(yǎng)箱，生化培養(yǎng)箱，冰箱，滅菌柜，超凈臺(tái)，液氮罐，超低溫冰箱，1.5mL凍存管，試管等。

2 菌種的復(fù)活

應(yīng)在環(huán)境潔凈度D級(jí)下的局部潔凈度不低于B級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，制備F1，（接收到合適菌種準(zhǔn)備使用時(shí)，應(yīng)根據(jù)菌種/細(xì)胞株的說明書制備復(fù)活的培養(yǎng)基對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株、細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)活。清潔安瓶（可用75%乙醇）后，用砂輪在安瓶的上部1/3處劃線，用干燥的無菌紗布包裹安瓶，將安瓶打開。用一無菌吸管吸取0.5-0.8mL適量的液體培養(yǎng)基（生抱梭菌用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、短小芽胞桿菌、銅綠假單胞菌和枯草芽抱桿菌用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基）滴加到安瓶中，輕輕旋轉(zhuǎn)安瓶并吹打，使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解，再將安瓶?jī)?nèi)的菌液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，根據(jù)菌種類型將其放入適宜的培養(yǎng)條件[需氧菌培養(yǎng)溫度（30-35）℃，18-24h；真菌培養(yǎng)溫度（20-25）℃，3-5d下培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基是否渾濁，渾濁說明菌種復(fù)活生長(zhǎng)，此為F1，如不渾濁，需氧菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至5天以上，真菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7d以上，仍不渾濁，按121℃，30min條件火菌處理，再對(duì)復(fù)活后的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株進(jìn)行純度和特性的確認(rèn)。

3 菌種的傳代

菌種是微生物實(shí)驗(yàn)中的重要輔助工具，所以其質(zhì)量非常重要，每一個(gè)菌種在使用前都需要進(jìn)過嚴(yán)格的測(cè)評(píng)才能投入實(shí)驗(yàn)中。微生物實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)性和精確性要求非常高的工作，所以對(duì)于試驗(yàn)中要用到的每一類菌種的復(fù)蘇、傳代和保存都有一套非常嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)及原則，已經(jīng)透過嚴(yán)格檢定、確定與相關(guān)條件相吻合的菌種才能執(zhí)行傳代步驟。另外，傳代工作流程在實(shí)際操作時(shí)也有非常嚴(yán)格的要求，傳代次數(shù)不宜過多，且要減少不必要的傳代工作，同時(shí)還要對(duì)傳代時(shí)的溫度進(jìn)行合理調(diào)控。

4 菌種的保藏

在菌種的復(fù)蘇及傳代工作完成后，實(shí)驗(yàn)室中的菌種管理工作體系已經(jīng)進(jìn)入最后一個(gè)環(huán)節(jié)，這一環(huán)節(jié)同樣是保證菌種質(zhì)量及功效的重要步驟。而在實(shí)驗(yàn)室的當(dāng)中對(duì)菌種進(jìn)行保藏的方法有很多，下面筆者就對(duì)幾種實(shí)驗(yàn)室中常見的菌種保藏方法進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

4.1 甘油冷凍管保藏法

甘油冷凍管保藏發(fā)是在實(shí)驗(yàn)室中一種非常常用的保藏手段，該方法的具體操作方法是使用無菌接種環(huán)對(duì)菌種表面的菌苔進(jìn)行刮取，然后利用接種環(huán)接觸試管的方式使細(xì)菌通過與試管壁的輕度摩擦向事先準(zhǔn)備好的放置于試管內(nèi)部的無菌蒸餾水中傳輸，或直接將菌放置于培養(yǎng)基當(dāng)中，同時(shí)還要對(duì)菌液的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，然后在調(diào)配完成后的菌懸液中添加體積相等、濃度標(biāo)準(zhǔn)是30%的無菌甘油，從而得出15%的甘油菌懸液。在操作過程中要保證所使用的甘油濃度保持在一個(gè)較低的程度，如果甘油濃度高于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)將會(huì)造成細(xì)菌細(xì)胞滲透壓力產(chǎn)生變化，最終導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生死亡的問題。在細(xì)菌傳導(dǎo)完成后需要對(duì)試管進(jìn)行振動(dòng)和搖蕩，在搖時(shí)要注意對(duì)力度的控制，讓試管內(nèi)的各種物質(zhì)達(dá)到充分融合，再將融合后的溶液分別放置于無菌小試管中，最后將制作完成的甘油冷凍管放入-20℃的低溫環(huán)境中進(jìn)行預(yù)凍處理，并將其放在低于-80℃的超低溫環(huán)境中存放，且要保證冰箱的溫度至少為-30℃，其在這種冷凍環(huán)境下通常能夠保留的時(shí)長(zhǎng)為2a，而乙型溶血性鏈球菌對(duì)保存溫度的要求較高，在超低溫環(huán)境下該菌種的可保存時(shí)長(zhǎng)為3個(gè)月。

4.3 斜面低溫保藏法

斜面低溫保藏法是一種過渡性較強(qiáng)的保藏方法，其保藏時(shí)間較短，該方法是通過將菌種轉(zhuǎn)移至條件合適的試管培養(yǎng)基上，或?qū)⑵滢D(zhuǎn)接在茄子瓶的固體培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行培養(yǎng)，在菌種成長(zhǎng)到一定程度之后再將其放入2-8℃的溫度環(huán)境中進(jìn)行保存。而微生物菌種的類型不同，其保存時(shí)間長(zhǎng)短也會(huì)有所差別。然而，這種保藏方法有一個(gè)非常突出的劣勢(shì)特點(diǎn)，就是采用這種方式進(jìn)行保存的菌種極易發(fā)生狀態(tài)改變，如果菌種發(fā)生變異會(huì)對(duì)其后期傳代效果造成影響，使菌種受到污染。所以，這種方法只能在需要保藏時(shí)間較短的菌種類型的保藏工作中使用，并且還要對(duì)菌種的保藏狀態(tài)進(jìn)行隨時(shí)檢查。

4.4 液氮超低溫保藏法

4.4.1 制備菌懸液

將需要保藏的菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，適宜溫度培養(yǎng)，當(dāng)菌落健壯地長(zhǎng)滿斜面時(shí)取出。配制30%的甘油溶液進(jìn)行121℃下高壓火菌30min，將生長(zhǎng)良好的菌種斜面用生理鹽水制成菌懸液，菌濃度控制在107左右，然后加入等體積甘油水溶液混勻后制成15%的甘油菌懸液。

4.4.2 分裝菌懸液

把購(gòu)買的1.5ml的塑料凍存管擰松管帽置一燒杯中，外扎紗布、牛皮紙包扎好進(jìn)行121℃高壓火菌30min。然后將制備好的菌懸液分裝至1.5mL的塑料凍存管中，每支凍存管加入1mL菌懸液，擰緊管帽，并用膠布封口，分別在膠布和凍存管上做好菌種標(biāo)記。

4.4.3 液氮保藏

將菌液保持在0攝氏度的狀態(tài)，然后將有關(guān)設(shè)備放置到零下70攝氏度左右的冰柜立面，然后進(jìn)行降溫。接著將相應(yīng)的凍存管放入到液氮罐妥善的保存，并且在罐的外面做好詳細(xì)的標(biāo)記工作，為以后使用菌種帶來方便。當(dāng)液氮中所存在的菌種需要復(fù)蘇時(shí)，這時(shí)操作人員就應(yīng)當(dāng)將菌種提出來，放置到大約35-40攝氏度的環(huán)境里面進(jìn)行充分的攪拌，從而達(dá)到解凍的目的。為了避免菌種出現(xiàn)污染的情況，操作人員需要用75%的酒精進(jìn)行擦拭，當(dāng)表面完全干燥以后就可以使用相應(yīng)的容器將菌液按種到相應(yīng)的培養(yǎng)基上做好培養(yǎng)工作。

結(jié)束語

綜上所述，對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室中的菌種進(jìn)行保存的方法有很多種，這些方法的正確使用對(duì)菌種的保存質(zhì)量的提高具有積極作用。然而，若方法使用不合理使菌種的保存質(zhì)量嚴(yán)重降低，不但無法達(dá)到有效提高菌種保存效果的目的，還會(huì)造成適得其反的結(jié)果，因此一定要建立起科學(xué)規(guī)范的菌種復(fù)蘇、傳代和保存體系，這樣才能有效提高菌種保藏的科學(xué)性和規(guī)范性，以促進(jìn)微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)效率的提高，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性，為微生物實(shí)驗(yàn)工作的完善奠定基礎(chǔ)，從而推動(dòng)該行業(yè)在我國(guó)快速發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

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