劉玉潔，耿惠

(1淄博礦業(yè)集團(tuán)集團(tuán)中心醫(yī)院，山東淄博255120；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

慢性高原病大鼠肝組織中扭轉(zhuǎn)原腸胚形成同系物1、鐵調(diào)素表達(dá)觀察

劉玉潔1，耿惠2

(1淄博礦業(yè)集團(tuán)集團(tuán)中心醫(yī)院，山東淄博255120；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察慢性高原病(CMS)大鼠肝組織中扭轉(zhuǎn)原腸胚形成同系物1(TWSG1)、鐵調(diào)素的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 50只雄性健康大鼠由西安運(yùn)至西寧，隨機(jī)分成6組，即低氧1組、低氧2組、CMS組、常氧1組、常氧2組、常氧3組。常氧1、2、3組分別在西寧(海拔2 260 m)常規(guī)飼養(yǎng)7、15、30 d。低氧1、2組和CMS組放入低壓氧倉(cāng)模擬海拔5 000 m環(huán)境，分別飼養(yǎng)7、15、30 d。CMS組成功制作CMS模型。采用qRT-PCR法檢測(cè)肝組織中的鐵調(diào)素、TWSG1 mRNA；采用免疫組化法檢測(cè)肝組織中的TWSG1蛋白。結(jié)果 低氧2組、CMS組肝組織中鐵調(diào)素mRNA相對(duì)表達(dá)量分別低于常氧2、3組，CMS組低于低氧1組(P均<0.05)。低氧1組、低氧2組、CMS組肝組織中TWSG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別高于常氧1、2、3組，低氧1組、低氧2組、CMS組TWSG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量依次增高(P均<0.05)。低氧1組、低氧2組、CMS組TWSG1蛋白表達(dá)陽(yáng)性分別為8、9、9例，常氧1、2、3組分別為8、8、8例。低氧2組、CMS組肝組織中TWSG1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別高于常氧2、3組，低氧1組、低氧2組、CMS組TWSG1蛋白相對(duì)表達(dá)量依次增高(P均<0.05)。結(jié)論 CMS大鼠肝組織中鐵調(diào)素表達(dá)下調(diào)，TWSG1表達(dá)上調(diào)；隨低氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，機(jī)體鐵調(diào)素和TWSG1表達(dá)變化越明顯，預(yù)示CMS狀態(tài)下鐵代謝逐漸發(fā)生改變。

慢性高原??；扭轉(zhuǎn)原腸胚形成同系物1；鐵調(diào)素

慢性高原病(CMS)是長(zhǎng)時(shí)間居住于海拔2 500 m以上地區(qū)的人群逐漸對(duì)低氧低壓環(huán)境不適應(yīng)而發(fā)生的臨床綜合征。CMS以紅細(xì)胞過(guò)度增生、低氧血癥為特征。鐵調(diào)素是一種由HAMP基因編碼的含有25個(gè)氨基酸的肝臟抗菌肽，是由8個(gè)半胱氨酸殘基組成的單一發(fā)夾結(jié)構(gòu)。鐵調(diào)素通過(guò)與膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FPN)結(jié)合并引起FPN內(nèi)化降解從而調(diào)節(jié)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)。鐵調(diào)素受炎癥因素和機(jī)體鐵含量增加的正性調(diào)節(jié)，受紅系增殖活性增加和缺氧的負(fù)性調(diào)節(jié)，上述過(guò)程主要有BMP-SMAD、JAK-STAT3和HFE-TfR2三條信號(hào)通路參與。扭轉(zhuǎn)原腸胚形成同系物1(TWSG1)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的鐵調(diào)控蛋白。TWSG1是一個(gè)高度保守的分泌性糖蛋白，含有24個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)疏水的信號(hào)序列。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TWSG1能通過(guò)抑制BMP-SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)間接抑制鐵調(diào)素合成。經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，有關(guān)CMS患者鐵代謝基因表達(dá)的研究尚不多見(jiàn)。為此，我們制備了慢性高原病大鼠模型，觀察大鼠肝組織中TWSG1、鐵調(diào)素的表達(dá)變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SPF級(jí)SD健康大鼠50只，鼠齡為42 d左右，體質(zhì)量200～300 g，由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。50只大鼠由西安運(yùn)至西寧，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分為6組，低氧1組8只、低氧2組9只、CMS組9只、常氧1組8只、常氧2組8只、常氧3組8只。

1.2 CMS模型建立及判定標(biāo)準(zhǔn) 常氧1、2、3組分別在西寧(海拔2 260 m)常規(guī)飼養(yǎng)7、15、30 d。低氧1、2組和CMS組放入低壓氧倉(cāng)模擬海拔5 000 m環(huán)境，分別飼養(yǎng)7、15、30 d。CMS模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)[1]：血紅蛋白>210 g/L，紅細(xì)胞比容>65%，有口唇、耳廓發(fā)紺等缺氧表現(xiàn)。根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，CMS組模型均制作成功。造模結(jié)束后麻醉大鼠，取腹主動(dòng)脈血1 mL送檢血常規(guī)；取出遠(yuǎn)離肝血管部位50 mg肝臟組織若干塊，RNA later固定，用于鐵調(diào)素、TWSG1 mRNA檢測(cè)；取出一塊遠(yuǎn)離肝血管部位的肝臟組織，4%多聚甲醛液固定，用于TWSG1蛋白檢測(cè)。

1.3 大鼠肝組織中鐵調(diào)素、TWSG1 mRNA檢測(cè) 根據(jù)TRIzol使用說(shuō)明書(shū)提取大鼠肝臟總RNA，選取OD260/OD280為1.8～2.0的RNA樣本，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用Primer Premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)目的基因、內(nèi)參基因actin引物序列，均由Invitrogen公司純化合成。TWSG1基因上游引物序列為5′-ATGAGTGTTGCGATTGTGT-3′，下游引物序列為5′-TGAAGTGGGAGGTGTGTC-3′；鐵調(diào)素基因上游引物序列為5′-CAACAGACGAGACAGACTACGG-3′，下游引物序列為5′-ACAAGGCTCTTGGCTCTCTATG-3′；內(nèi)參β-actin基因上游引物序列為5′-CCTAGACTTCGAGCAAGAGA-3′，下游引物序列為5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGA-3′。qRT-PCR反應(yīng)在ABI7500 PCR儀上進(jìn)行，每組設(shè)陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min,1個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s,35個(gè)循環(huán)。采用ABI7500軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 大鼠肝組織中TWSG1蛋白檢測(cè) 采用免疫組化法。肝組織標(biāo)本經(jīng)固定、脫鈣、石蠟包埋、切片后，進(jìn)行免疫組化染色。TWSG1陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色至棕褐色。根據(jù)著色程度、著色顆粒大小與陽(yáng)性細(xì)胞百分比判定結(jié)果：無(wú)色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分，無(wú)顆粒計(jì)0分、細(xì)顆粒計(jì)1分、中顆粒計(jì)2分、粗顆粒計(jì)3分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分、陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤25%計(jì)1分、>25%～50%計(jì)2分、>50%～75%計(jì)3分、>75%計(jì)4分；將三項(xiàng)得分相加，0～2分為-，3～5分為+，6～7分為++，8～9分為+++，10分為++++。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織中鐵調(diào)素、TWSG1 mRNA表達(dá)比較 低氧2組、CMS組肝組織中鐵調(diào)素mRNA相對(duì)表達(dá)量分別低于常氧2、3組，CMS組低于低氧1組(P均<0.05)。低氧1組、低氧2組、CMS組肝組織中TWSG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別高于常氧1、2、3組，低氧1組、低氧2組、CMS組TWSG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量依次增高(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠肝組織中TWSG1蛋白表達(dá)比較 免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖1。低氧1組、低氧2組、CMS組TWSG1蛋白陽(yáng)性分別為8、9、9例，常氧1、2、3組分別為8、8、8例。低氧2組、CMS組肝組織中TWSG1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別高于常氧2、3組，低氧1組、低氧2組、CMS組TWSG1蛋白相對(duì)表達(dá)量依次增高(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肝組織中鐵調(diào)素、TWSG1 mRNA及TWSG1蛋白表達(dá)比較

注：與低氧1組比較，▲P<0.05；與低氧2組比較，■P<0.05；與CMS組比較，★P<0.01。

注：A為常氧1組；B為常氧2組；C為常氧3組；D為低氧1組；E為低氧2組；F為CMS組。

3 討論

CMS主要由機(jī)體缺氧造成的，慢性缺氧條件下(如慢性阻塞性肺疾病、右到左心臟分流術(shù)和高海拔環(huán)境)，低氧誘導(dǎo)因子(HIF)能通過(guò)協(xié)調(diào)細(xì)胞特定類(lèi)型缺氧反應(yīng)，包括增加腎臟和肝臟中促紅細(xì)胞生成素(EPO)的生成、促進(jìn)紅系祖細(xì)胞成熟和增殖的骨髓微環(huán)境改變、提高鐵攝取和利用等，從而促進(jìn)紅細(xì)胞生成[2]。紅細(xì)胞生成增加源于骨髓來(lái)源的系統(tǒng)信號(hào)，這種系統(tǒng)信號(hào)抑制了鐵調(diào)素的表達(dá)，研究[3]發(fā)現(xiàn)參與這種信號(hào)通路的因子可能包括骨髓中紅系前體細(xì)胞產(chǎn)生的循環(huán)分子，如生長(zhǎng)分化因子15(GDF15)及TWSG1。鐵調(diào)素受抑制后FPN水平增高，進(jìn)而增加用于紅細(xì)胞生成的鐵的可用性[2]。本課題分別設(shè)計(jì)了常氧組和低氧組，并模擬海拔5 000 m制備CMS大鼠模型，觀察低氧狀態(tài)及不同低氧暴露時(shí)間條件下大鼠肝組織中鐵調(diào)素、TWSG1的表達(dá)變化，進(jìn)而分析CMS對(duì)鐵代謝的影響及其機(jī)制。

Nicolas等[4]在氧濃度為0.1%～2%的條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與氧濃度為20%的常氧條件下相比，細(xì)胞中鐵調(diào)素mRNA表達(dá)明顯下降。研究[5]證明高海拔急性缺氧條件下，紅細(xì)胞生成和血紅蛋白合成所需的鐵急劇增加，血漿鐵調(diào)素濃度下降。有學(xué)者[6,7]發(fā)現(xiàn)CMS大鼠鐵調(diào)素水平明顯降低。本研究結(jié)果顯示，低氧2組、CMS組肝組織中鐵調(diào)素 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別低于常氧2、3組，CMS組低于低氧1組，表明低氧環(huán)境下鐵調(diào)素表達(dá)下調(diào)，在CMS狀態(tài)下更加明顯，其原因可能與低氧抑制鐵調(diào)素表達(dá)有關(guān)。低氧抑制鐵調(diào)素表達(dá)的途徑可能包括：①低氧下啟動(dòng)HIF-1α直接與鐵調(diào)素基因啟動(dòng)子上氧反應(yīng)原件(HREs)作用，降低鐵調(diào)素表達(dá)；②低氧能夠通過(guò)HIF-1α使弗林蛋白酶(Furin)分泌增多，F(xiàn)urin是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中能分解鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白(HJV)的蛋白酶，從而釋放可溶性鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白(sHJV)，而sHJV通過(guò)與BMPs結(jié)合、減少受體-配體相互作用，拮抗鐵調(diào)素的作用；③低氧狀態(tài)下HIF-1α可調(diào)節(jié)跨膜絲氨酸蛋白酶6(TMPRSS6)水平，并通過(guò)BMP-SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)性調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達(dá)[8]；④通過(guò)血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)通路抑制鐵調(diào)素合成[9]；⑤低氧使無(wú)調(diào)性同系物8(ATOH8)水平下降而發(fā)揮抑制鐵調(diào)素的作用[10]；⑥低氧下HIF-2促使腎臟EPO生成和紅細(xì)胞生成，骨髓來(lái)源的系統(tǒng)信號(hào)因子可能包括GDF-15和TWSG1抑制鐵調(diào)素表達(dá)[3]。

Mirciov等[11]在β-地中海貧血、缺鐵性貧血大鼠的骨髓和脾臟中檢測(cè)到TWSG1和GDF15。TWSG1是細(xì)胞外基質(zhì)中BMP信號(hào)調(diào)節(jié)器之一，它能根據(jù)環(huán)境正性或負(fù)性地調(diào)節(jié)BMP的活性[12～19]。有學(xué)者[20]研究發(fā)現(xiàn)TWSG1在惡性肝臟上皮細(xì)胞癌中表達(dá)增加，且與BMP4表達(dá)有關(guān)。Tanno等[13]在人肝癌細(xì)胞株HuH-7和初級(jí)人類(lèi)肝臟細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，TWSG1在紅細(xì)胞生成的早期階段(相對(duì)成熟階段)表達(dá)增加，能通過(guò)抑制BMP2/BMP4與BMP受體結(jié)合，抑制Smad1/5/8的磷酸化，達(dá)到間接抑制鐵調(diào)素合成的作用。Kroot等[14]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)腎臟產(chǎn)物EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成，然后通過(guò)GDF15、TWSG1與肝臟細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，從而影響鐵調(diào)素的表達(dá)，這可能是通過(guò)抑制BMP/SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)完成的。

本研究結(jié)果顯示，低氧1組、低氧2組、CMS組肝組織中TWSG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別高于常氧1、2、3組，低氧1組、低氧2組、CMS組TWSG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量依次增高；低氧2組、CMS組肝組織中TWSG1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別高于常氧2、3組，低氧1組、低氧2組、CMS組TWSG1蛋白相對(duì)表達(dá)量依次增高。上述結(jié)果表明，隨缺氧時(shí)間和缺氧程度的增加，TWSG1表達(dá)逐漸增加，且在CMS中維持高表達(dá)。分析其原因，CMS狀態(tài)下，隨缺氧時(shí)間和程度增加，紅細(xì)胞生成對(duì)鐵的需求增加，進(jìn)一步通過(guò)GDF15/TWSG1介導(dǎo)HIF-2對(duì)鐵調(diào)素表達(dá)的抑制作用，調(diào)節(jié)鐵代謝，從而為紅細(xì)胞生成提供充足的原料。但對(duì)于CMS狀態(tài)下TWSG1與紅系增殖之間的關(guān)系仍不明確。

總之，CMS大鼠肝組織中鐵調(diào)素表達(dá)下調(diào)，TWSG1表達(dá)上調(diào)；隨低氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，機(jī)體鐵調(diào)素和TWSG1表達(dá)變化越明顯，預(yù)示鐵代謝狀態(tài)逐漸發(fā)生改變。

[1] 靳國(guó)恩,韻海霞,馬蘭,等.高原紅細(xì)胞增多癥動(dòng)物模型的建立及其生理功能反應(yīng)[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(24):4713-4716.

[2] Volker H. Hypoxic regulation of erythropoiesis and iron metabolism[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2010, 299(1):1-13.

[3] Fleming RE, Ponka P. Iron overload in human disease[J]. N Engl J Med, 2012, 366:348-359.

[4] Nicolas G, Chauvet C, Viatte L, et al. The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia, hypoxia, and inflammation [J]. J Clin Invest, 2002,110(7):1037-1044.

[5] Talbot N, Lakhal S, Smith T, et al. Regulation of hepcidin expression at high altitude[J]. Blood, 2012,119(3):857-860.

[6] 耿惠.高原紅細(xì)胞增多癥大鼠模型的sTfR和hepcidin表達(dá)[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,36(1):6-10.

[7] 耿惠,陳碧琴.GDF-15在慢性高原病大鼠模型中的表達(dá)及其與hepcidind的關(guān)系[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(4):2255-2257.

[8] Mastrogiannaki M, Matak P, Mathieu JR, et al. Hepatic hypoxia-inducible factor-2 down-regulates hepcidin expression in mice through an erythropoietin-mediated increase in erythropoiesis[J]. Haematologica, 2012,97(6):827-834.

[9] Sonnweber T, Nachbaur D, Schroll A, et al. Hypoxia induced downregulation of hepcidin is mediated by platelet derived growth factor BB[J]. Gut, 2014,63(12):1951-1959.

[10] Patel N, Varghese J, Masaratana P, et al. The transcription factor ATOH8 is regulated by erythropoietic activity and regulates HAMP transcription and cellular pSMAD1,5,8 levels[J]. Br J Haematol, 2014,164(4):586-596.

[11] Mirciov CS, Wilkins SJ, Dunn LA, et al. Characterization of putative erythroid regulators of hepcidin in mouse models of anemia[J]. PLoS One, 2017,12(1):e0171054.

[12] Troilo H, Barrett A, Zuk A, et al. Structural characterization of twisted gastrulation provides insights into opposing functions on the BMP signalling pathway[J]. Matrix Biol, 2016,55(1):49-62.

[13] Tanno T, Porayette P, Sripichai O, et al. Identification of TWSG1 as a second novel erythroid regulator of hepcidin expression in murine and human cells[J]. Blood, 2009,114(1):181-186.

[14] Kroot J, Tjalsma H, Fleming R, et al. Hepcidin in human iron disorders: diagnostic implications[J]. Clin Chem, 2011,57(12):1650-1669.

[15] Pham L, Beyer K, Jensen E, et al. Bone morphogenetic protein 2 signaling in osteoclasts is negatively regulated by the BMP antagonist, twisted gastrulation[J]. J Cell Biochem, 2011,112(3):793-803.

[16] Huntley R, Davydova J, Petryk A, et al. The Function of Twisted Gastrulation in Regulating Osteoclast Differentiation is Dependent on BMP Binding[J]. J Cell Biochem, 2015,116(10):2239-2246.

[17] Forsman C, Ng B, Heinze R, et al. BMP-binding protein Twisted gastrulation is required in mammary gland epithelium for normal ductal elongation and myoepithelial compartmentalization[J]. Dev Biol, 2013,373(1):95-106.

[18] Heinke J, Juschkat M, Charlet A, et al. Antagonism and synergy between extracellular BMP modulators Tsg and BMPER balance blood vessel formation[J]. J Cell Sci, 2013,126(14):3082-3094.

[19] Yamada S, Nakamura J, Asada M, et al. Twisted Gastrulation, a BMP Antagonist, Exacerbates Podocyte Injury[J]. PLoS One, 2014,9(2):e89135.

[20] Johnston J, Al-Bahrani R, Abuetabh Y, et al. Twisted gastrulation expression in cholangiocellular and hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Pathol, 2012,65(10):945-948.

青海省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014-ZJ-720)。

耿惠(E-mail: gh0227@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.008

R594.3

A

1002-266X(2017)15-0031-04

2016-05-19)