招麗蓉 王 巍 伍 婧 胡 斌 林秀強 徐綺華 林 奔 馮 芬 陳永昌

VEGF的SNP狀態(tài)預測貝伐株單抗治療轉移性結直腸癌的長期療效

招麗蓉 王 巍 伍 婧 胡 斌 林秀強 徐綺華 林 奔 馮 芬 陳永昌

目的 檢測轉移性結直腸癌患者外周血血管內皮生長因子(VEGF)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，探討VEGF的SNP與患者預后的關系。方法 60例轉移性結直腸癌患者的外周血樣本，均接受過標準的化療，其中20例加用了貝伐珠單抗，應用MassARRAY方法，成功進行9個VEGF的SNP的檢測，包括-2578C>A、-460T>C、-1455T>C、-1154G>A、-634G>C、-398G>A、-497T>C、-2455>-T、-936C>T。結果 60例轉移性結直腸癌患者，聯(lián)合靶向治療組的總生存期優(yōu)于單用化療組(P=0.01)，VEGF各SNP變異率與NDBI數(shù)據(jù)庫相似，-1455T>C 變異率極低，無臨床價值；-2578C>A和-460C>T變異具有較高一致性；入組患者中SNP-497TT純合子患者總生存期劣于其他患者(P=0.02)；應用貝伐株單抗患者，SNP-497 3種基因型總生存期均有明顯差異(P=0.01)，SNP-398AA純合變異者總生存期優(yōu)于其他患者(P=0.02)SNP—2455 CC純合子者總生存期優(yōu)于其他患者(P=0.01)。結論 在轉移性結直腸癌，外周血VEGF的SNP狀態(tài)與貝伐珠單抗以及化療的長期療效可能相關，需要進一步增加病例，加強這方面的研究。

轉移性結直腸癌；貝伐珠單抗；血管內皮生長因子：基因多態(tài)性

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:531～535)

在中國結直腸癌發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢[1]，治療復發(fā)轉移性結直腸癌的主要方法是化療聯(lián)合靶向治療。其中貝伐珠單抗通過特異性結合患者外周血內血管內皮生長因子(VEGF)起血管靶向治療作用，使患者中位生存期延長到2年以上[2]，但貝伐株單抗價格較貴，且有心腦血管損傷等比較嚴重的副作用[3]。無論是化療還是貝伐珠單抗，仍無公認的療效或毒性預測因子。國外有研究顯示，轉移性結直腸癌患者在接受貝伐單抗聯(lián)合伊立替康為基礎化療后，VEGF-2578 AA和VEGF-1154 AA基因型預后較好[4]，但相關研究較少。本研究針對60例轉移性結直腸癌患者，測定其治療前VEGF基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，進行長期生存隨訪，結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

自2011年1月至2015年12月在佛山市第一人民醫(yī)院治療的60例轉移性結直腸癌患者，有可評價的病灶，接受正規(guī)一線化療。

60例患者中男性35例，女性25例；年齡33～73歲，中位年齡58歲；ECOG體能狀況評分均≤2，其中38例應用以奧沙利鉑為基礎化療方案(mFOLFOX6或者Xelox),22例應用FOLFIRI化療方案。根據(jù)相應化療方案，其中20例聯(lián)合貝伐珠單抗治療，應用5 mg/kg體重，靜脈滴注每2周1次，或者7.5 mg/kg靜脈滴注，每3周1次。化療之前留取患者血標本，化療之后進行密切隨訪。

1.2 儀器與試劑

基因擴增儀(Bio-rad)，MassARRAY質譜分析儀(sequenom)，MassARRAY微量點樣儀(sequenom)，complete iPLEX?Gold Genotyping Reagent Set 10*384(sequenom)，快速DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，引物和探針(Thermo Fisher scientific)。

1.3 目標SNP及引物設計

針對有報道的VEGF的10個常見SNP進行引物設計，根據(jù)MassARRAY實驗原理，設計兩條擴增引物實現(xiàn)對目標片段的擴增，另外針對每個SNP還需要設計一條單堿基延伸反應引物，延伸引物位于變異位點前一個堿基，在變異位點處可延伸一個堿基(表1)。用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF/MS)可區(qū)分延伸堿基的分子量，從而判斷目的基因是否變異。具體見表1。

表1 MassARRAY引物及探針設計表

1.4 檢測流程

樣本收集：收集外周血，4 000 rmp離心10 min，去除血清，將白膜層收集用紅細胞裂解液處理后，將白細胞保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 DNA提取和鑒定 使用快速DNA提取試劑盒，按照說明書提取白細胞的總DNA。Nanodrop 2000分光光度計定量檢測基因組DNA純度、濃度；并使用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察基因組DNA的降解狀況。

1.4.2 質譜分析引物設計 質譜分析軟件設計，具體見表1。PCR擴增反應：PCR緩沖液(10×)0.5 μL、Mgcl2(25 mM)0.4 μL、dNTPs(25 mM)0.1 μL、PCR熱啟動酶(5 U/μL)0.2 μL、擴增引物混合液1 μL、基因組DNA(10 ng/μL)2 μL，水補足至5 μL。反應條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，45個循環(huán)；72 ℃ 5 min。SAP化處理：蝦堿性磷酸酶(shrimp alka-line phosphatase，SAP)去除PCR 產物中dNTP。在PCR 產物中加入SAP(1.7 U/μL)0.3 μL、SAP 緩沖液(10×)0.17 μL、水補足至7 μL。反應條件為：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。單堿基延伸反應：上述得到的產物中加入iplex緩沖液(10×)0.2 μL、iplex terminator 0.2 μL、iplex 酶0.041 μL、延伸引物混合液0.94 μL、水補足至9 μL。反應條件為：94 ℃ 30 s；[94 ℃ 5 s、(52 ℃ 5 s、80 ℃ 5 s)5個循環(huán)]，40個循環(huán)；72 ℃ 3 min。樹脂純化：在產物中加16μL水，將清潔樹脂平鋪到6 mg的樹脂板中(96 孔板)，將樹脂倒入延伸產物中，封膜，旋轉板30～60 min 進行脫鹽去離子防干擾處理；3000×g離心5 min，使樹脂沉入孔底部。芯片點樣及檢測：MassARRAY系統(tǒng)點樣儀對延伸產物進行芯片點樣，利用分析儀掃描芯片。數(shù)據(jù)分析：掃描結果以Typer 4.0軟件分析。根據(jù)變異位點處堿基分子量不同，時間飛行質譜掃描區(qū)分各目的基因的變異狀況，在質譜峰變異堿基處出現(xiàn)峰，則判斷為變異。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用均數(shù)t檢驗，應用Kaplan-meier法進行Log Rank生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 變異頻率

結果顯示成功檢測的60個結直腸癌樣本9個SNP檢測匯總及變異頻率分布，總體來講，與NCBI數(shù)據(jù)庫變異率相似。值得注意的是，-2578C>A和-460C>T變異具有較高一致性(59/60 98.3%)，60例患者中59例在純合、雜合變異及純合變異3個方面完全一致，應用了貝伐珠單抗的患者兩個SNP位點變異狀態(tài)完全一致，見表2。

表2 60個結直腸癌樣本MassARRAY測SNP匯總

2.2 生存分析

總體患者及應用貝伐株單抗治療的患者均進行了生存分析，中位總生存期(OS)為16.0個月(95% CI:9.3～22.7)；聯(lián)合貝伐株單抗患者中位OS 34.0個月(95% CI:26.5～44.4)，單用化療組中位OS為12.7個月(95% CI:10.8～14.6)，差別有統(tǒng)計學差異(P=0.01)，見圖1；在所有患者中SNP-497TT純合子患者總生存期差于其他患者(P=0.02)見圖2；在應用貝伐株單抗患者，SNP-497 3種基因型總生存期均有明顯差異(P=0.01)見圖3，SNP-398AA純合變異者總生存期優(yōu)于其他患者(P=0.02)見圖4，SNP-2455 CC純合子者總生存期優(yōu)于其他患者(P=0.01)見圖5。

圖1 不同治療方案患者生存期比較

圖2 研究人群中SNP-497TT純合子患者總生存期

圖3 應用貝伐株單抗患者SNP-497三種基因型總生存期

圖4 應用貝伐株單抗患者SNP-398AA純合變異者 總生存期

圖5 應用貝伐株單抗患者SNP-2455CC純合子者 總生存期

3 討論

經過科學界的不斷努力，轉移性結直腸癌的中位生存期已經達到30月左右[5]。貝伐珠單抗在其中起到重要作用，但價格昂貴，有腦白質變性、心血管事件和腸穿孔等多種嚴重并發(fā)癥[6-7]，急需要找出療效因子指導醫(yī)生合理應用。多項大型Ⅲ期臨床試驗(AVF2107g，AVAiL,AVOREN，E4599)的回顧性分析結果是陰性的，無論是腫瘤組織的免疫組化表達，還是治療前血漿基線VEGF濃度水平，均與貝伐珠單抗的療效無明確相關性[8]。

由于免疫組化的先天局限性，加上貝伐珠單抗在外周血結合VEGF的特性，近年的研究集中于外周血的療效預測因子。Willett等開展的一項Ⅱ期臨床試驗[9]顯示，32例局部直腸癌患者接受貝伐珠單抗單藥治療后的血漿VEGF濃度較治療前升高，且可能與原發(fā)灶和淋巴結縮小有一定關系，而單獨接受標準放化療的患者治療前后血漿VEGF濃度無明顯變化。因此有可能治療前后血漿VEGF濃度變化水平，跟貝伐單抗療效相關性更大，但VEGF濃度測定比較麻煩，技術標準不統(tǒng)一，抽血的時間點很難確定，需要多次抽血。

同時，VEGF存在多個SNP，在乳腺癌治療研究中，評價了VEGF基因多態(tài)性與藥物療效及毒性之間的關系，該試驗在兩個治療組中對所有候選基因型與療效進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)VEGF-2578和-1154位點均位于VEGF基因啟動子區(qū)域，純合子變異者在貝伐株單抗治療組中預示患者中位OS更長，但在對照組中這兩種基因型均未提示與患者PFS和RR有關[10]。

關于腸癌的回顧性分析[4]亦發(fā)現(xiàn)，在接受貝伐單抗聯(lián)合伊立替康為基礎治療轉移性結直腸癌患者，VEGF-2578 AA和-1154 AA純合子變異基因型預示較好的生存。研究的缺陷是僅僅分析了化療聯(lián)合貝伐單抗治療的轉移性直腸癌患者，并沒有對單獨化療的生存進行比較；但后來又發(fā)表的另兩項類似研究[11-12]中，VEGF的SNPs與轉移性結直腸癌療效相關性仍不確定。

國內這方面的文獻還比較少，因此本研究納入了60例患者進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)對于VEGF基因區(qū)域的10個SNP，MassARRAY成功檢測出9個位點的SNP狀況，其變異狀態(tài)與NCBI數(shù)據(jù)庫相似，rs833062T>C位點變異率低于1%，無臨床意義；-2578C>A和-460C>T變異具有較高一致性(59/60 98.3%),在應用了貝伐珠單抗的患者兩個位點狀態(tài)完全一致，未見文獻報道，亟待下一步擴大試驗例數(shù)進行驗證。

在全體患者進行生存分析，可以看到貝伐珠單抗顯著延長了患者生存期；在所有患者中SNP-497TT純合子患者總生存差于其他患者(P=0.02)；在應用貝伐株單抗患者，SNP-497三種基因型總生存均有明顯差異(P=0.01)，SNP-398AA純合變異者總生存優(yōu)于其他患者(P=0.02)，SNP-2455 CC純合子者總生存優(yōu)于其他患者(P=0.01)，-2578AA純合子者1例仍存活，預后最好，但與其他患者差別無統(tǒng)計學意義。結果似乎與國外學者報道并不一致，但在僅有的20例接受貝伐株單抗聯(lián)合化療的患者，不同SNP基因型之間確實存在生存期差別，值得進一步增加病例和SNP數(shù)量。

下一步研究者已經開始前瞻性留取應用貝伐珠單抗治療者的血標本，同時增加研究中心數(shù)量，有條件時開展VEGF血清動態(tài)監(jiān)測，力爭早日獲得貝伐珠單抗療效的預測因子。

[1] Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015〔J〕.CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[2] Saltz LB,Clarke S,Diaz-Rubio E,et al.Bevacizumab in co- mbination with oxaliplatin-based chemotherapy as first-line therapy in MCRC:a randomized phase Ⅲ study〔J〕.J Clin Oncol,2008,26(13):2013-2019.

[3] 王 巍,馮 芬,林秀強，等.貝伐珠單抗聯(lián)合化療導致昏迷2例并文獻復習〔J〕.中國腫瘤臨床,2013,40(24):1563-1566.

[4] Koutras AK,Antonacopoulou AG,Eleftheraki AG,et al.Va- scular endothelial growth factor polymorphisms and clinical outcome in colorectal cancer patients treated with irinotecan-based chemotherapy and bevacizumab〔J〕.Pharmacogenomics J,2012,12(6):468-475.

[5] Ilic I,Jankovic S,Ilic M.Bevacizumab Combined with Che- motherapy Improves Survival for Patients with Metastatic Colorectal Cancer:Evidence from Meta Analysis〔J〕.PLoS One,2016,11(8):e0161912.

[6] Wang W,Zhao LR,Lin XQ,et al.Reversible posterior leukoencephalopathy syndrome induced by bevacizumab plus chemotherapy in colorectal cancer〔J〕.World J Gastroenterol,2014,20(21):6691-6697.

[7] Botrel TE,Clark LG,Paladini L,et al.Efficacy and safety of bevacizumab plus chemotherapy compared to chemotherapy alone in previously untreated advanced or metastatic colorectal cancer:a systematic review and meta-analysis〔J〕.BMC Cancer,2016,16:677.

[8] Luo HY,Xu RH.Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer〔J〕.World J Gastroenterol,2014,20(14):3858-3874.

[9] Willett CG,Duda DG,di Tomaso E,et al.Efficacy,safety,and biomarkers of neoadjuvant bevacizumab,radiation therapy,and fluorouracil in rectal cancer:a multidisciplinary phase II study〔J〕.J Clin Oncol,2009,27(18):3020-3026.

[10] Baar J,Silverman P,Lyons J,et al.A vasculature-targeting regimen of preoperative docetaxel with or without bevacizumab for locally advanced breast cancer:impact on angiogenic biomarkers〔J〕.Clin Cancer Res,2009,15(10):3583-3590.

[11] Loupakis F,Cremolini C,Yang D,et al.Prospective validation of candidate SNPs of VEGF/VEGFR pathway in metastatic colorectal cancer patientstreated with first-line FOLFIRI plus bevacizumab〔J〕.PLoS One,2013,8(7):e66774.

[12] Hansen TF,Christensen Rd,Andersen RF,et al.The predictive value of single nucleotide polymorphisms in the VEGF system to the efficacy of first-line treatment with bevacizumab plus chemotherapy in patients with metastatic colorectal cancer:results from the Nordic ACT trial〔J〕.Int J Colorectal Dis,2012,27(6):715-720.

(編輯：吳小紅)

Relationship between Peripheral Blood VEGF Promoter Region SNP and Prognosis of Patients with Metastatic Colorectal Cancer

ZHAOLirong，WANGWei,WUJing,etal.

TheFirstPeople’sHospitalofFoshan,Foshan,528000

Objective To detect single nucleotide polymorphism (SNP)in vascular endothelial growth factor (VEGF)promoter region in metastatic colorectal cancer patients，and explore the relationship between the SNP and prognosis.Methods Peripheral blood samples were taken from 60 metastatic colorectal cancer patients in our hospital.These patients received standard chemotherapy.20 cases received chemotherapy plus bevacizumab.Three SNPs in VEGF promoter region were detected successfully by MassARRAY method,including-2578C> A,-460T> C and-1455T> C.Results The over survival (OS)in 20 cases with bevacizumab was better than other cases (34.0m vs 12.7m),(P=0.004).The SNP status for each site was similar with NDBI database.-2578C> A and-460C> T mutation had a high consistency in the overall patient.Patients with-497 TT genotype had worse overall survival than other patients (P =0.02).In the patients received bevacizumab,three SNP-497 genotypes related to three significantly different prognosis(P=0.01),SNP-398AA homozygous variation related to superior overall survival (P=0.02),SNP-2455 CC homozygotes related to better overall survival (P=0.01).Conclusion In metastatic colorectal cancer,the VEGF SNP status may be related to the long-term efficacy of bevacizumab and chemotherapy.A further research with more cases is needed to test our hypotheses.

Metastatic colorectal cancer;Bevacizumab;Vascular endothelial growth factor(VEGF)；Single nucleotide polymorphism(SNP)

佛山市科技局科研項目(編號：2014AB00278)

528000 廣東省佛山市第一人民醫(yī)院

王 巍

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.003

R735.3+7

A

1001-5930(2017)04-0531-05

2017-01-16

2017-03-02)