莊婉玉，黃曉真，卜婉萍，張志燦，林麗莉，林棟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

端粒酶基因敲除小鼠行為學(xué)特征的增齡性變化研究

莊婉玉，黃曉真，卜婉萍，張志燦，林麗莉，林棟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

目的通過(guò)對(duì)端粒酶基因敲除小鼠衰老特點(diǎn)的初步認(rèn)識(shí)，為衰老領(lǐng)域的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法分別選用2、3、5、7和9月齡的純合子與同月齡的野生型端粒酶基因敲除小鼠相對(duì)照，從老化度評(píng)分、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)等方面觀察純合子小鼠行為活動(dòng)的增齡性變化。結(jié)果與野生型小鼠比較，純合子小鼠隨月齡增加其老化度評(píng)分呈升高趨勢(shì)，且5、7和9月齡的老化度評(píng)分高于同齡野生型小鼠（P<0.05）；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，相比較野生型小鼠，純合子小鼠定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期隨月齡增加而有增長(zhǎng)趨勢(shì)，且7和9月齡的逃避潛伏期長(zhǎng)于同齡野生型小鼠（P<0.05），而在空間探索試驗(yàn)的逃避潛伏期目標(biāo)象限時(shí)間隨月齡增加而呈下降趨勢(shì)，與野生型小鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2、3和5月齡純合子小鼠固定時(shí)間內(nèi)自主活動(dòng)次數(shù)與同齡野生型小鼠比較無(wú)顯著變化，而7和9月齡純合子小鼠與同齡野生型小鼠比較固定時(shí)間內(nèi)自主活動(dòng)次數(shù)減少（P<0.05）。結(jié)論與同齡野生型端粒酶基因敲除小鼠比較，純合子端粒酶基因敲除小鼠隨月齡增大，其行為活動(dòng)出現(xiàn)明顯增齡性變化，表現(xiàn)出系列衰老特征，尤其7和9月齡衰老表現(xiàn)更為明顯。

端粒酶基因敲除小鼠；行為活動(dòng)；增齡性變化；衰老

端粒酶基因敲除小鼠（telomerase-deficient，Terc-/-）是指野生型C57BL/J小鼠3號(hào)染色體的端粒酶基因組分用新霉素片段替換，其端粒酶表達(dá)缺失，其后代均表現(xiàn)出3～5 kb/代進(jìn)行性端?？s短和末端融合增快趨勢(shì)，當(dāng)端粒低于臨界長(zhǎng)度時(shí)會(huì)導(dǎo)致小鼠端粒功能紊亂[1-2]，進(jìn)而表現(xiàn)出全身性多系統(tǒng)自然衰老征象，其皮膚、大腦、內(nèi)臟和其他器官均發(fā)生老化，出現(xiàn)嗅覺(jué)衰退、不育、腸部和脾臟受損等疾病。

目前國(guó)內(nèi)衰老領(lǐng)域的研究多使用快速老化小鼠（senescence accelerated mouse，SAM）或采用O3吸入、輻射和D-半乳糖等方法制造的衰老模型鼠，Terc-/-小鼠是國(guó)內(nèi)衰老領(lǐng)域研究中較新穎的模型鼠，更接近自然衰老，更能真實(shí)地反應(yīng)機(jī)體衰老的各種生理病理狀態(tài)，是衰老相關(guān)研究的理想模型。為了將其更好地應(yīng)用于衰老領(lǐng)域的研究，對(duì)其衰老特點(diǎn)的研究顯得十分必要。本研究擬從老化度評(píng)分、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)等方面考察Terc-/-小鼠行為活動(dòng)的增齡性變化，從而初步了解該類小鼠的衰老特點(diǎn)，為衰老領(lǐng)域相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

Terc-/-小鼠由上海茂生衍生物科技有限公司從美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室代理引進(jìn)（Stock#004132，貨號(hào)No：MS13-127），置于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心無(wú)特定病原體級(jí)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物室進(jìn)行保種、育種。待第3代無(wú)特定病原體級(jí)端粒酶基因敲除小鼠3～4周齡時(shí)行腮叢靜脈采血，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法進(jìn)行基因型鑒定，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度轉(zhuǎn)基因350 bp、野生型180 bp。根據(jù)PCR結(jié)果隨機(jī)選出2、3、5、7和9月齡純合子Terc-/-小鼠各8只，作為實(shí)驗(yàn)組；同時(shí)選用相同條件的同齡野生型Terc-/-小鼠各8只，作為正常對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1老化度評(píng)分應(yīng)用老化度評(píng)分表[3]從反應(yīng)性、被動(dòng)性逃避反應(yīng)、皮毛光澤、皮毛粗糙度、脫毛程度、皮膚潰瘍、眼周損害、角膜渾濁、角膜潰瘍、白內(nèi)障、脊柱后凸等11項(xiàng)指標(biāo)對(duì)各組小鼠進(jìn)行客觀評(píng)分。每項(xiàng)指標(biāo)劃分為4～5級(jí)不等，標(biāo)定分值。最后統(tǒng)計(jì)分值，積分越高表明其老化度越高。

圖1　Terc-/-小鼠PCR鑒定結(jié)果

1.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮測(cè)定系統(tǒng)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制。實(shí)驗(yàn)裝置主要由直徑120 cm、高50 cm的圓形水池，直徑12.5 cm、高28cm的圓形平臺(tái)及圖像采集記錄裝置組成。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，池內(nèi)水深約30cm，高出平臺(tái)1～2 cm，以防動(dòng)物看到池內(nèi)平臺(tái)，水溫保持（20±1）℃，將水池人為劃分成4個(gè)象限，因Terc-/-小鼠毛發(fā)為黑色，故在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在其后背貼上白色防水膠布以助系統(tǒng)識(shí)別，示蹤小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。在正式實(shí)驗(yàn)前，已對(duì)Terc-/-小鼠進(jìn)行水迷宮平臺(tái)可視測(cè)試的預(yù)實(shí)驗(yàn)，即將平臺(tái)露出水面約2cm，并在平臺(tái)上放一紅色旗幟，以增強(qiáng)平臺(tái)可視度，從而排除該小鼠存在視覺(jué)及攀爬能力等方面的缺陷。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為5d，單次實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)為60s，目標(biāo)區(qū)域時(shí)間定為3s。第1～4天為定位劃行實(shí)驗(yàn)，將平臺(tái)放在第3象限，每天訓(xùn)練4次，小鼠分別從不同象限入水，觀察小鼠在60 s內(nèi)能否找到平臺(tái)，如果能找到且在平臺(tái)停留3 s以上，系統(tǒng)將自動(dòng)終止實(shí)驗(yàn)并記錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間及運(yùn)動(dòng)軌跡等，若未找到實(shí)驗(yàn)將在第60秒自動(dòng)終止，并將小鼠置于平臺(tái)上停留10s，該階段旨在考察動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力。第5天為空間探索實(shí)驗(yàn)，僅實(shí)驗(yàn)1次，將平臺(tái)撤掉，小鼠固定從第1象限入水，觀察小鼠60s內(nèi)在第3象限時(shí)間等相關(guān)情況，以考察動(dòng)物的記憶能力。見(jiàn)圖2。

圖2　Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.3自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)小鼠自主活動(dòng)程序自動(dòng)控制儀由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制造。儀器共設(shè)有6個(gè)獨(dú)立空箱，6只小鼠可同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)先將小鼠放入箱中適應(yīng)5min后再測(cè)定，記錄10min內(nèi)小鼠的活動(dòng)次數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1老化度評(píng)分結(jié)果

研究結(jié)果表明，純合子和野生型小鼠老化度評(píng)分值均隨年齡增長(zhǎng)而增加。2和3月齡時(shí)兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），5、7和9月齡時(shí)，與野生型比較，純合子小鼠的評(píng)分值增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Terc-/-小鼠在1～9月生存期內(nèi)，野生型并未出現(xiàn)明顯的衰老表征，而純合子在5月齡時(shí)即迅速出現(xiàn)明顯的衰老征象，比野生型小鼠提前進(jìn)入衰老期。見(jiàn)圖3。

圖3　不同月齡純合子和野生型Terc-/-小鼠老化度評(píng)分的增齡性變化（±s）

2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中小鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間為逃避潛伏期，純合子和野生型小鼠均在2、3、5、7及9月齡時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，不同月齡純合子和野生型小鼠的逃避潛伏期采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。結(jié)果：①2、3及5月齡時(shí)的純合子與野生型小鼠的逃避潛伏期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F2月齡=8.751，P2月齡=0.593； F3月齡=0.023，P3月齡=0.876；F5月齡=3.560，P5月齡=0.688），②7、9月齡時(shí)的純合子與野生型小鼠的逃避潛伏期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F7月齡=0.098，P7月齡=0.001；F9月齡=4.158，P9月齡=0.000），純合子小鼠的逃避潛伏期比野生型小鼠延長(zhǎng)。見(jiàn)表1和圖4。

表1　不同月齡純合子和野生型小鼠的平均逃避潛伏期（n=8±s）

表1　不同月齡純合子和野生型小鼠的平均逃避潛伏期（n=8±s）

組別2月齡3月齡5月齡7月齡9月齡純合子44.00±7.86 47.71±6.43 48.91±8.05 50.74±6.06 50.98±3.14野生型42.37±3.11 48.26±7.18 47.65±3.26 38.53±5.58 35.77±7.13

圖4　不同月齡純合子和野生型小鼠逃避潛伏期的增齡性變化（n=8±s）

逃避潛伏期的目標(biāo)象限時(shí)間比是指在第5天的空間探索實(shí)驗(yàn)中，小鼠在目標(biāo)象限的時(shí)間占總時(shí)間的比值，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。不同月齡純合子和野生型小鼠逃避潛伏期的目標(biāo)象限時(shí)間比采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。結(jié)果：①純合子與野生型小鼠在2、3及5月齡時(shí)的目標(biāo)象限時(shí)間比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F2月齡=4.286，P2月齡=0.658；F3月齡=3.992，P3月齡=0.825；F5月齡=1.033，P5月齡=0.445）；②純合子與野生型小鼠在7和9月齡時(shí)的目標(biāo)象限時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F7月齡=0.665，P7月齡=0.009；F9月齡= 0.016，P9月齡=0.046），純合子小鼠的目標(biāo)象限時(shí)間比野生型小鼠減少。見(jiàn)表2和圖5。

2.3自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本次研究結(jié)果表明，兩組小鼠在2、3和5月齡時(shí)的自主活動(dòng)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而7和9月齡時(shí)的自主活動(dòng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），野生型小鼠的自主活動(dòng)隨年齡增加無(wú)明顯變化，而純合子小鼠則隨月齡增加而逐漸減少。見(jiàn)圖6。

表2　不同月齡純合子和野生型小鼠逃避潛伏期的目標(biāo)象限時(shí)間比（n=8±s）

表2　不同月齡純合子和野生型小鼠逃避潛伏期的目標(biāo)象限時(shí)間比（n=8±s）

組別2月齡3月齡5月齡7月齡9月齡純合子0.24±0.050.29±0.180.24±0.140.19±0.100.19±0.10野生型0.22±0.080.28±0.060.29±0.100.33±0.080.31±0.11

圖6　不同月齡純合子和野生型小鼠的自主活動(dòng)

3 討論

當(dāng)今社會(huì)老齡化現(xiàn)象日益嚴(yán)重，有關(guān)衰老及衰老相關(guān)疾病的分子機(jī)制的研究日益受到關(guān)注。隨著近年來(lái)對(duì)端粒和端粒酶的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶與衰老之間存在相關(guān)性，衰老的端粒學(xué)說(shuō)也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。有研究表明[4]，1、2代Terc-/-小鼠表現(xiàn)出的早衰尚不明顯，一般到第3代及之后端粒出現(xiàn)明顯縮短，染色體端融合，進(jìn)而出現(xiàn)壽命縮短、生殖力下降、組織萎縮及器官功能損害等早衰現(xiàn)象。Terc-/-小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)則表現(xiàn)為腦部縮小，大腦早衰，海馬區(qū)BDNF表達(dá)低于正常，且易引起阿爾茨海默癥、帕金森病等腦部衰老性疾病[5-9]。筆者尚未閱讀到國(guó)內(nèi)用Terc-/-小鼠來(lái)進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的研究報(bào)道，試圖以該Terc-/-小鼠為模型，研究該小鼠的行為學(xué)變化。

老化度評(píng)分是根據(jù)小鼠的外在表現(xiàn)及行為變化來(lái)評(píng)定其機(jī)體的老化程度，它反映機(jī)體的衰老征象[3]，從本次的研究結(jié)果看，不同基因型Terc-/-小鼠隨月齡的增加所表現(xiàn)出的衰老征象不同，純合子和野生型小鼠在2和3月齡時(shí)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而5、7和9月齡時(shí)純合子小鼠得分均明顯高于野生型小鼠，表明純合子小鼠一般在5月齡以前尚未表現(xiàn)出衰老征象，在經(jīng)過(guò)一段相對(duì)正常的生長(zhǎng)期后，大約在5月齡時(shí)開(kāi)始有別于正常小鼠，進(jìn)入快速衰老期而出現(xiàn)明顯的衰老征象。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)旨在檢測(cè)動(dòng)物空間搜索和辨別的學(xué)習(xí)記憶能力，以動(dòng)物找到隱藏于水中平臺(tái)的潛伏期和動(dòng)物在目標(biāo)象限的探索時(shí)間等多項(xiàng)指標(biāo)來(lái)評(píng)定動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力[10]。本次研究結(jié)果顯示，在5月齡及5月齡前，純合子和野生型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但7月齡及7月齡以后，純合子小鼠與野生型小鼠比較，潛伏期明顯延長(zhǎng)，探索過(guò)程中在目標(biāo)象限的時(shí)間明顯減少，表明其學(xué)習(xí)記憶能力較野生型小鼠明顯下降。

自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)是通過(guò)測(cè)試動(dòng)物在一定時(shí)間內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)，反應(yīng)動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能狀態(tài)，一般動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮時(shí)活動(dòng)次數(shù)增加，抑制時(shí)則活動(dòng)次數(shù)減少[11]。本次研究結(jié)果顯示，純合子和野生型小鼠的自主活動(dòng)在2、3和5月齡時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在7和9月齡時(shí)兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，純合子小鼠自主活動(dòng)隨月齡增加逐漸減少，說(shuō)明純合子小鼠隨月齡的增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性逐漸降低，尤其在7月齡及以后更明顯。

上述研究結(jié)果證實(shí)，純合子Terc-/-小鼠與野生型Terc-/-小鼠相比，其外在體征、學(xué)習(xí)記憶能力及自主活動(dòng)等均出現(xiàn)了增齡性的快速衰老現(xiàn)象，且衰老多發(fā)生在7月齡以后。Terc-/-小鼠是一種自然衰老模型，能更真實(shí)地反應(yīng)機(jī)體的衰老狀態(tài)，可作為衰老領(lǐng)域研究的理想衰老模型，在衰老機(jī)制、治療等方面的研究中具有很好的應(yīng)用前景。

[1]梁愛(ài)玲,黃迪南,侯敢.mterc-/-小鼠在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2005,1:49-53.

[2]SAMPER E,FERNANDEZ P,EGUIA R,et al.Long-term repopulating ability of telomerase-deficient murine hematopoietic stem cells[J].Blood,2002,99(8):2767-2775.

[3]HOSOKAWA M,KASAI R,HIGUCHI K,et al.Grading score system:a method for evaluation of the degree of senescence in senescence accelerated mouse(SAM)[J].Mech Ageing Dev,1984, 26(1):91-102.

[4]BLASCO M A,LEE H W,HANDE M P,et al.Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA[J].Cell,1997,91(1):25-34.

[5]PANOSSIAN L A,PORTER V R,VALENZUELA H F,et al. Telomere shortening in T cells correlates with Alzheimer's disease status[J].Neurobiol Aging,2003,24(1):77-84.

[6]ZHANG J,KONG Q,ZHANG Z,et al.Telomere dysfunction of lymphocytes in patients with Alzheimer disease[J].Cogn Behav Neurol,2003,16(3):170-176.

[7]MAEDA T,GUAN J Z,KOYANAGI M,et al.Aging-associated alteration of telomere length and subtelomeric status in female patients with Parkinson's disease[J].J Neurogenet,2012,26(2): 245-251.

[8]KOLIADA A K,VA?SERMAN A M,KRASNENKOV D S,et al. The study of telomere length in patients with Parkinson's disease[J]. Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova,2014,114(8):58-61.

[9]ZHAN Y,SONG C,KARLSSON R,et al.Telomere length shorteningandalzheimerdisease-amendelianrandomization study[J].JAMA Neurol,2015,72(10):1202-1203.

[10]MORRISR.Developmentsofa water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J].JNeurosci Methods, 1984,11(1):47-60.

[11]涂人順,張國(guó)璽,孫斌輝.關(guān)于小鼠自主活動(dòng)規(guī)律的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2002,4:464-465.

（申海菊編輯）

Aging changes of behaviour characteristics in telomerase knockout mice*

Wan-yu Zhuang，Xiao-zhen Huang，Wan-ping Bu，Zhi-can Zhang，Li-li Lin，Dong Lin（Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350122，China）

Objective To systematically study aging changes of behavior characteristics in the telomerase knockout mice，so as to provide experimental basis for research in the field of aging using the model mice. Methods Homozygote telomerase knockout mice of 2，3，5，7 and 9 months were selected and compared with wild telomerase knockout mice of the corresponding age.The aging changes of behavior characteristics in the homozygote mice were observed from aging degree score，Morris water maze experiment and independent activity experiment.Results Compared with the wild type mice，the homozygote mice showed an increasing trend of aging degree score，which was specially obvious in the mice of 5，7 and 9 months compared with the wild type mice of the corresponding age（P＜0.05）.In the Morris water maze experiment，compared with the wild type mice，the homozygote mice had a growing trend in sea trial with the increase of months，the escape latency of the 7-and 9-month homozygote mice was significantly longer than that of the wild type mice of the corresponding age（P＜0.05）；while in the space exploration trial the escape latency of the target quadrant showed a downward trend with increasing month age，which was statistically different from that of the wild mice（P＜0.05）.The independent activity experiment revealed，there were no significant changes in the number of autonomic activities within a fixed time between the homozygote mice and the wild type mice

telomerase knockout mice；behavior activity；aging change；aging

R 339.38

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.001

1005-8982（2016）19-0001-05*of 2，3 and 5 months，while the number of autonomic activities within a fixed time in the homozygote mice of 7 and 9 months was significantly reduced compared to the wild mice of the corresponding age（P＜0.05）. Conclusions Compared with wild type telomerase knockout mice of the same age，the homozygote mice have apparent aging changes in their activities，and show a series of aging characteristics，particularly in mice of 7 and 9 months.

2016-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81273672）；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目（No：2014-ZQN-JC-28）；福建省自然科學(xué)基金（No：2014J01353）

林棟，E-mail：bluelike1@sina.com