王 剛 沈根海 高泉根

IRF-2對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性及化療敏感性的影響

王 剛 沈根海 高泉根

目的 探討干擾素調(diào)控因子2(interferon regulatory factor 2,IRF-2)在胰腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)特性及其對吉西他濱化療敏感性的影響。方法 Western blot檢測IRF-2基因在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1及MIAPaCa-2中的表達(dá)水平，采用MTT檢測吉西他濱對PANC-1及MIAPaCa-2的半數(shù)有效濃度(IC50)，選擇較為耐藥的PANC-1細(xì)胞進(jìn)行IRF-2基因干擾表達(dá)，并采用MTT檢測吉西他濱對PANC-1及干擾IRF-2表達(dá)的PANC-1 si 1#的半數(shù)有效濃度(IC50)。結(jié)果 PANC-1及MIAPaCa-2中細(xì)胞中均存在IRF-2基因的表達(dá)，且PANC-1細(xì)胞中表達(dá)水平比MIAPaCa-2高。吉西他濱對PANC-1細(xì)胞的IC50顯著高于MIAPaCa-2細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干擾IRF-2表達(dá)的PANC-1 si 1#細(xì)胞其IC50值顯著低于PANC-1對照細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 IRF-2基因可作為影響胰腺癌對吉西他濱化療敏感性的基因之一，干擾IRF-2基因能夠有效地提升胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱化療的敏感性。

干擾素調(diào)控因子2；胰腺癌；吉西他濱；化療敏感性

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:542～544)

胰腺癌是惡性程度較高的一種腫瘤，由于早期診斷率低，多數(shù)胰腺癌確診時已為中晚期，因此化療是多數(shù)胰腺癌患者的綜合治療的主要方法之一[1-2]。吉西他濱仍代表著胰腺癌化療的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方案[3]。但是由于其內(nèi)源性的耐藥導(dǎo)致其臨床上的療效一般，因此近年來一系列的體外實(shí)驗(yàn)嘗試檢測對吉西他濱化療敏感性產(chǎn)生影響的分子指標(biāo)。干擾素調(diào)控因子-2(interferon regulatory factor-2,IRF-2)為干擾素調(diào)控因子家族中的一員，其生物學(xué)功能涉及到機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)過程。有文獻(xiàn)[4-6]報道IRF-2參與了原發(fā)性肝癌、Kaposi's肉瘤等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，Sakai等[5]研究證實(shí)IRF-2的高表達(dá)水平與胰腺癌的進(jìn)展呈密切關(guān)聯(lián)，說明其在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要的作用。但是關(guān)于IRF-2在胰腺癌中的細(xì)胞生物學(xué)的特性及其對吉西他濱化療敏感性的影響，目前國內(nèi)報道并不多見。本研究擬探討IRF-2對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性及化療敏感性的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANCl及MiaPaCa-2購于美國ATCC(American Type Culture Collection)，上述胰腺癌細(xì)胞株在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所選用的藥物吉西他濱(生產(chǎn)批號131022江蘇豪森醫(yī)藥公司生產(chǎn))，0.2 g/支。

1.2 研究方法

1.2.1 Western blot檢測IRF-2基因在PANC-1及MIAPaCa-2細(xì)胞系中的表達(dá) 取對數(shù)生長期的PANC-1及MIAPaCa-2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后予以提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待顯色后再于硝酸纖維素膜上置入含DAB的緩沖液中，同時采用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝像，分別檢測2個細(xì)胞系的IRF-2蛋白表達(dá)情況。

1.2.2 PANC-1及MIAPaCa-2細(xì)胞吉西他濱的IC50檢測 將PANC-1及MIAPaCa-2細(xì)胞均勻地鋪在96孔板中，過夜貼壁后分別用濃度為0.1、1、10、100 μg/ml的吉西他濱處理細(xì)胞72 h，每個時間點(diǎn)均做3個平行孔，最后用MTT法檢測細(xì)胞的增殖率(OD值)，并與各自無藥物處理的對照組進(jìn)行對比，計(jì)算PANC-1及MIAPaCa-2細(xì)胞吉西他濱的半數(shù)有效濃度(IC50)，IC50的計(jì)算公式為：lg IC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4],其中Xm為lg最大濃度，I為lg(最大濃度/相鄰濃度)，P為陽性反應(yīng)率之和，Pm為最大陽性反應(yīng)率，Pn為最小陽性反應(yīng)率。

1.2.3 不同IRF-2表達(dá)水平的PANC-1細(xì)胞吉西他濱的IC50檢測 用氯化鈣轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得慢病毒，將慢病毒進(jìn)行高速離心純化，然后將不同濃度慢病毒感染PANC-1細(xì)胞后采用siRNA技術(shù)下調(diào)IRF-2基因的表達(dá)，并命名為PANC-1 si 1#,具體方法見參考文獻(xiàn)[7]。將等量的未處理的PANC-1細(xì)胞和PANC-1 si 1#細(xì)胞均勻的鋪在96孔板中，過夜貼壁后用1.2.2中的方法處理細(xì)胞72 h，并檢測IC50值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PANC-1及MIAPaCa-2細(xì)胞系中IRF-2的表達(dá)及其IC50情況

Western blot檢測結(jié)果示IRF-2基因在PANC-1細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于MIAPaCa-2細(xì)胞系，見圖1。MTT結(jié)果示PANC-1細(xì)胞的IC50值為(16.72±2.33)μg/ml，顯著高于MIAPaCa-2細(xì)胞的(5.82±1.34)μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 PANC-1及MIAPaCa-2細(xì)胞系中IRF-2的表達(dá)情況

圖2 吉西他濱作用PANC-1及MIAPaCa-2細(xì)胞的IC50比較

2.2 下調(diào)IRF-2的表達(dá)對PANC-1細(xì)胞吉西他濱化療敏感性的影響

PANC-1細(xì)胞的IC50值為(15.87±2.14)μg/ml，顯著高于PANC-1 si 1#細(xì)胞的(9.63±1.44)μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 下調(diào)IRF-2的表達(dá)對PANC-1細(xì)胞吉西他濱化療 敏感性的影響

3 討論

化療尤其是吉西他濱在胰腺癌綜合治療中占有舉足輕重的作用，單獨(dú)或者以吉西他濱為基礎(chǔ)的多種胰腺癌化療方案能夠顯著延長胰腺癌患者的生存期[8]。吉西他濱是目前胰腺癌綜合治療中最常用的化療藥物之一，它是一種細(xì)胞周期特異性的抗代謝藥物，主要作用于處于G1期及S期的腫瘤細(xì)胞，能夠阻止腫瘤細(xì)胞由G1期轉(zhuǎn)向S期分裂，轉(zhuǎn)化后的活性物質(zhì)競爭性的抑制DNA鏈延長，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。然而由于細(xì)胞的凋亡和周期改變常常由許多相互影響的網(wǎng)格化信號通路控制著，因此任何信號通路上的調(diào)控蛋白改變都可能使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對化療藥物的耐藥性。多項(xiàng)研究[9-10]已經(jīng)證實(shí)相關(guān)基因參與了吉西他濱的耐藥，說明胰腺癌患者對吉西他濱化療的耐藥性是一種多基因參與、多信號通路介導(dǎo)的分子生物學(xué)事件[11]。因此對胰腺癌患者產(chǎn)生耐藥的相關(guān)基因的檢測顯得尤為必要。

本研究結(jié)果表明PANC-1細(xì)胞中IRF-2基因的表達(dá)水平高于MIAPaCa-2細(xì)胞，同時MTT結(jié)果顯示吉西他濱對PANC-1細(xì)胞作用的IC50也顯著高于MIAPaCa-2細(xì)胞，說明IRF-2基因在不同的胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平存在差異，而且這種差異可能影響其對吉西他濱化療的敏感性。為證實(shí)IRF-2對胰腺癌吉西他濱化療的敏感性，本研究進(jìn)一步通過沉默PANC-1細(xì)胞IRF-2基因的表達(dá)，并用吉西他濱處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)干擾IRF-2基因表達(dá)的PANC-1細(xì)胞對吉西他濱的IC50值顯著低于正常表達(dá)者。表明選擇性的IRF-2基因的低表達(dá)能夠增加胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱化療的敏感性。IRF-2是定位于4號染色體長臂的基因之一，其不僅在免疫調(diào)節(jié)以及干擾素信號通道中發(fā)揮作用，還可作為癌基因通過調(diào)控細(xì)胞凋亡及周期轉(zhuǎn)變參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。IRF-2能夠激活促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行G1-S期細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和DNA復(fù)制必須的調(diào)控原件-組蛋白H4轉(zhuǎn)錄。此外IRF-2還能夠通過轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔兊腘-ras基因?qū)е录?xì)胞生長受到抑制、抑制巨噬細(xì)胞的凋亡等途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[4]。有研究[6]表明與IRF-2的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域一旦出現(xiàn)點(diǎn)突變就可使腫瘤細(xì)胞的增殖受到顯著的抑制，因而可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。此外有研究[12]證實(shí)在胰腺癌的吉西他濱化療過程中Ⅰ型干擾素能夠增強(qiáng)其對化療的敏感性，而IRF-2基因則在Ⅰ型干擾素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起到一定的促進(jìn)作用。這充分說明IRF-2在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

總之，IRF-2基因可作為影響胰腺癌對吉西他濱化療敏感性的基因之一。根據(jù)胰腺癌表達(dá)的遺傳學(xué)和腫瘤標(biāo)志物來選擇合適的治療策略是未來胰腺癌個體化靶向治療的發(fā)展方向[13]，因此IRF-2基因有可能作為未來個體化靶向治療新的靶點(diǎn)。但是其確切的分子生物學(xué)機(jī)制仍需深入細(xì)致的研究，以證實(shí)其確實(shí)參與并介導(dǎo)了對化療的耐藥。

[1] 蘇維宏,孫 備.胰腺癌化療:替吉奧與吉西他濱的應(yīng)用及展望〔J〕.中華胰腺病雜志,2014,14(1):69-72.

[2] 李慧超,王 寧,鄭榮壽,等.中國2010年胰腺癌發(fā)病和死亡分析〔J〕.中國腫瘤,2015,24(3):163-169.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會胰腺外科學(xué)組.胰腺癌診治指南(2014版)〔J〕.中華消化外科雜志,2014,13(11):831-837.

[4] Kim Y,Cha S,Seo T.Activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway by viral interferon regulatory factor 2 of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016,470(3):650-6.

[5] Sakai T,Mashima H,Yamada Y,et al.The roles of interferon regulatory factors 1 and 2 in the progression of human pancreatic cancer〔J〕.Pancreas,2014，43(6):909-16.

[6] Yi Y,Wu H,Gao Q,et al.Interferon regulatory factor (IR- F)-1 and IRF-2 are associated with prognosis and tumor invasion in HCC〔J〕.Ann Surg Oncol,2013，20(1):267-76.

[7] 崔 磊.IRF-2在胰腺癌中的功能及其對胰腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響〔D〕.復(fù)旦大學(xué),2012.

[8] 張?zhí)?曹 喆,趙玉沛，等.胰腺癌的化療與放療〔J〕.中華消化外科雜志,2015,14(8):619-622.

[9] 鄭衍玲,李 艷,羅紅敏,等.Smac/DIABLO誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡并增加對TRAIL及吉西他濱化療的敏感性〔J〕.中華普通外科雜志,2013,28(3):211-214.

[10] 張建新,蔣海華,毛正發(fā),等.富含半胱氨酸的酸性蛋白增加胰腺癌對吉西他濱化療敏感性的機(jī)制〔J〕.中華腫瘤雜志,2014,36(5):335-340.

[11] 劉笑然,田孝東,楊尹默,等.胰腺癌化療耐藥研究的現(xiàn)狀與進(jìn)展〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2013,30(1):10-12.

[12] Hayashi T,Ding Q,Kuwahat T,et al.Interferon-alpha (IF- N-alpha)modulates the chemosensitivity of CD33-expressing pancreatic cancer cells to gemcitabine〔J〕.Cancer Sci,2012,103(5):9-16.

[13] 王三妹,陳寶安.胰腺癌的細(xì)胞治療新進(jìn)展〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志,2015,22(3):369-374.

(編輯：甘 艷)

Effect of IRF-2 on the Cellular Biological Characteristics and Chemosensitivity ofPancreatic Cancer

WANGGang,SHENGenhai,GAOQuangen.

TheFirstPeople'sHospitalofWujiangDistrict,Suzhou,215200

Objective To study the effect of IRF-2 on cellular biological characteristics and chemosensitivity of pancreatic cancer cells.Methods The expression level of IRF-2 in PANC-1 and MIAPaCa-2 cell lines were detected with Western blot,and the IC50 of PANC-1 and MIAPaCa-2 cell lines were detected with MTT.The IRF-2 gene were interfed in PANC-1 cell lines(named with PANC-1 si 1#),and the IC50 of PANC-1 and PANC-1 si 1# cell lines were also detected by MTT.Results PANC-1 and MIAPaCa-2 cells exist in IRF-2 gene expression,PANC-1 cells than MIAPaCa-2 high,gemcitabine PANC-1 cells median effective dose was higher than MIAPaCa-2,and the difference was statistically significant(P<0.05),the IC50 values of interference IRF-2-expressing cells was lower than PANC-1 control cells.Conclusion lRF-2 gene is one of the gene which could influence the sensitivity of pancreatic cancer to gemcitabine chemotherapy,and IRF-2 specific interference technology could effectively enhance chemosensitivity pancreatic cancer cells to gemcitabine.

IRF-2;Pancreatic cancer;Gemcitabine;Chemosensitivity

215200 江蘇省蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.006

R735.9

A

1001-5930(2017)04-0542-03

2016-06-02

2016-11-04)