陳干濤 楊 瀟 程艷香

·基礎(chǔ)研究·

LncRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)譜變化及意義

陳干濤 楊 瀟 程艷香

目的 研究宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)變化情況，為探討lncRNA參與宮頸癌發(fā)生與發(fā)展提供分子依據(jù)。方法 取20例宮頸癌患者的宮頸癌組織和20例正常宮頸組織，應(yīng)用高通量lncRNA芯片技術(shù)分別檢測兩組中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的變化情況，并應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對結(jié)果加以驗(yàn)證。結(jié)果 與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中共有30586條lncRNA和13982條mRNA存在差異性表達(dá)，通過GO聚類分析表明，上調(diào)mRNA和下調(diào)mRNA分別參與多種不同的生物過程。通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)變化差異性最明顯的10個(gè)lncRNA可能通過影響相應(yīng)的mRNA來發(fā)揮其生物學(xué)功能。qRT-PCR 結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致，提示4個(gè)lncRNA(BC008359,RP11-521B24.5,BRE-AS1,和RP11-229P13.15)在宮頸癌組織中發(fā)揮重要作用。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)闡述了宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA的變化情況，為探討lncRNA參與宮頸癌發(fā)生與發(fā)展以及治療提供新的分子依據(jù)。

宮頸癌組織；lncRNA；高通量lncRNA芯片技術(shù)

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:523～527)

宮頸癌(cervical cancer)是最常見的婦科惡性腫瘤之一,僅次于乳腺癌，且宮頸癌發(fā)病呈年輕化趨勢[1]。非編碼RNA(Non-coding RNAs)是指不翻譯為蛋白但是具調(diào)節(jié)作用的功能性RNA分子，包括siRNA、miRNA和長鏈非編碼RNA(lncRNA)。lncRNA是一類長度超過200nt的RNA[2]。近年來由于測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)lncRNA通常存在于核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中，廣泛參與個(gè)體發(fā)育和生命過程的調(diào)控，并與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)疾病狀態(tài)下非編碼RNA的表達(dá)存在差異，提示未來可將非編碼RNA作為生物指標(biāo)進(jìn)行疾病診斷和預(yù)測[3-5],因此對其功能深入了解可作為腫瘤診斷和治療的檢測指標(biāo)，且可迅速用于實(shí)際領(lǐng)域[3,6]。

本研究應(yīng)用高通量lncRNA芯片技術(shù)檢測20例正常宮頸組織和20例宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的變異，篩選出差異表達(dá)的lncRNA，進(jìn)行聚類分析，篩選出與宮頸癌相關(guān)的lncRNA，為進(jìn)一步闡明宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床治療提供潛在的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

20例宮頸癌組織來自2015年1月至2015年6月在武漢市人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的宮頸癌患者；20例正常宮頸組織來自其他婦科手術(shù)患者，均證實(shí)為正常子宮組織。標(biāo)本采集均經(jīng)過患者家屬簽署知情同意書并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 材料

提取RNA的Trizol(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR-Green Real-time PCR Master Mix試劑盒(ABI公司)；real-time PCR引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成;Human lncRNA Microarrays V 3.0的芯片選擇、探針設(shè)計(jì)、圖像采集、數(shù)據(jù)分析等由上?？党缮锕就瓿伞?/p>

1.3 芯片的選擇

利用Arraystar公司所開發(fā)出的12×135k的lncRNA芯片，其覆蓋目前NCBI Refseq、UCSC Known Gene、RNAdb，NRED等多個(gè)數(shù)據(jù)庫的lncRNA種類。

1.4 探針設(shè)計(jì)

Arraystar lncRNA芯片設(shè)計(jì)的探針為60 met的長寡核苷酸，這些探針在高嚴(yán)格雜交條件下能夠得到高靈敏度以及高特異性的理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果。并且，針對每條序列都設(shè)計(jì)多條探針，增加了信號(hào)的可靠度。

1.5 組織樣本總RNA的提取與檢測

按照Trizol(Invitrogen)說明書，分別取120 mg的組織樣本，按照試劑說明，分別從正常組織和宮頸癌組織抽提總RNA。通過紫外分光光度計(jì)測定吸光度值260、280、230 nm的吸收值，對總RNA進(jìn)行計(jì)算濃度并評估純度；同時(shí)結(jié)合甲醛變性凝膠瓊脂電泳檢測RNA純度及完整性。

1.6 cDNA樣品合成、標(biāo)記和雜交

利用Invitrogen公司提供的cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成雙鏈互補(bǔ)DNA；利用Nimblegen公司的DNA標(biāo)記試劑盒進(jìn)行雙鏈互補(bǔ)DNA的標(biāo)記，使用分光光度計(jì)檢測熒光標(biāo)記效率，以保證后續(xù)芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性；利用NimbleGen提供的雜化系統(tǒng)進(jìn)行排列雜交，然后利用Nimblegen清洗液試劑盒進(jìn)行清洗。

1.7 圖像采集和數(shù)據(jù)分析

利用Agilent Microarray Scanner (Agilent p/n G2565BA)掃描芯片掃描熒光強(qiáng)度，然后將掃描圖像輸入Agilent Feature Extraction軟件，以進(jìn)行網(wǎng)格對齊與表達(dá)數(shù)據(jù)分析。通過分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化以及Agilent Feature Extraction軟件內(nèi)將表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范，后用Agilent Gene Spring Software軟件分析。芯片選擇，探針設(shè)計(jì)，圖像采集和數(shù)據(jù)分析由上海康成生物完成。

1.8 Real-timePCR檢測lncRNA變化

選差異性變化最大的lncRNA通過Real-timePCR 進(jìn)行驗(yàn)證。采用ABI 7300熒光定量PCR儀，SYBR Green熒光染料(ABI公司)摻入法相對定量，同時(shí)以內(nèi)參GAPDH為參照，計(jì)算差異表達(dá)的倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA表達(dá)芯片結(jié)果

將40個(gè)組織樣本定量進(jìn)行高通量lncRNA芯片雜交，檢測宮頸癌組織與正常宮頸組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜，表達(dá)譜數(shù)據(jù)通過t檢驗(yàn)分析，繪制散點(diǎn)圖(Scatter Plot)，以差異倍數(shù)Fold>2倍且P<0.05為篩選條件，篩選出顯著性差異表達(dá)的lncRNA(圖1)。共檢測出30586條lncRNA，進(jìn)行聚類分析和比較后，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的lncRNA共22043條。其中11545條表達(dá)上調(diào)，10498條表達(dá)下調(diào)，在所有的表達(dá)差異lncRNA 中，RP11-44K6.2表達(dá)上升倍數(shù)最多，為404.26倍；RP4-781K5.4為下降倍數(shù)最多的lncRNA,為-529.83倍。同時(shí)檢測mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)13982 個(gè)mRNA表達(dá)出現(xiàn)差異性變化，其中5867個(gè)表達(dá)上升和7115表達(dá)下降。在這些變化的mRNA中，SAA2為表達(dá)上升倍數(shù)最多(7784.59倍)的mRNA,而SERPINB3為下降倍數(shù)最多的mRNA(-6948.15倍)。

圖1 lncRNA表達(dá)散點(diǎn)圖

2.2 聚類分析獲得參與宮頸癌的mRNA的相關(guān)功能和信號(hào)通路

基因本體論(gene ontology，GO)是基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系，分為分子功能(Molecular Function)，生物過程(biological process)和細(xì)胞組分(cellular component)三部分。

通過GO聚類分析發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中，上調(diào)mRNA(Fold>2)多與細(xì)胞膜成分相關(guān)，具有受體反應(yīng)和離子通道等分子功能，參與了刺激反應(yīng)，信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞交流等生物過程(圖2 A,B,C)；下調(diào)mRNA(Fold>2)與細(xì)胞膜細(xì)胞器成分相關(guān)，具有蛋白錨定和能量傳遞等功能，參與了核苷酸代謝，嘌呤代謝和核苷磷酸代謝等生物過程(圖2 D,E,F)。參考KEGG Pathway，根據(jù)分子參與的功能，表達(dá)差異性變化的mRNA可能參與了鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)吞，細(xì)胞粘附和神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)以及一些信號(hào)通路如MAPK，p53，Ras和Wnt等信號(hào)通路(圖3)。

注：A,B和C代表上調(diào)mRNA的細(xì)胞過程,細(xì)胞組分和分子功能分析圖；D,E和F代表下調(diào)mRNA的細(xì)胞過程,細(xì)胞組分和分子功能分析圖。 圖2 mRNA差異表達(dá)的Go分析圖

注：左圖為上調(diào)，右圖為下調(diào)。 圖3 上調(diào)和下調(diào)mRNA的通路分析圖

2.3 lncRNA和mRNA共差異表達(dá)譜以及l(fā)ncRNA功能預(yù)測

很多研究表明lncRNA能夠通過影響mRNA表達(dá)情況來發(fā)揮其生物學(xué)功能。KEGG Pathway根據(jù)分子參與的功能，以Pathway Map形式展示每個(gè)通路中基因(蛋白質(zhì))、小分子等網(wǎng)絡(luò)。對差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行通路分析以推斷它們參與的通路。對此我們分析了變化差異性最明顯的10個(gè)lncRNA，尋找出了與其變化密切相關(guān)的mRNA,這些lncRNA可能通過影響相應(yīng)的mRNA來發(fā)揮其生物學(xué)功能，有可能成為研究宮頸癌的標(biāo)志分子。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果驗(yàn)證芯片結(jié)論

為了驗(yàn)證芯片的結(jié)果，采用定量PCR法隨機(jī)測定4個(gè)變化明顯的lncRNA(BC008359,RP11-521B24.5,BRE-AS1,和RP11-229P13.15)在宮頸癌組織中表達(dá)情況。與正常組織相比，BC008359,RP11-521B24.5均出現(xiàn)了20倍以上的上升,而 BRE-AS1和RP11-229P13.15分別降低了70倍和25倍(圖4)。上述結(jié)果表明，定量PCR結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致，證明lncRNA芯片結(jié)果可靠。

圖4 qRT-PCR檢驗(yàn)lncRNA芯片

3 討論

關(guān)于lncRNA在宮頸癌方面已經(jīng)有很多研究，Gibb等檢測了宮頸瘤變組織中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在CIN1，CIN2和CIN3期組織中l(wèi)ncRNA均有差異表達(dá)[7]。其激活和失活均能從分子水平調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長[8]。近年來測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，一些lncRNA逐漸被提出和發(fā)現(xiàn)。HOTAIR被發(fā)現(xiàn)在多種原癌組織中表達(dá)，Huang等檢測了218例宮頸癌患者HOTAIR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在癌變組織中存在高表達(dá)[9]，提示該分子可以作為宮頸癌診斷和轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物[9-10]。王文玲等用PFLP檢測發(fā)現(xiàn)，H19在宮頸癌組織中高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)[11]，同時(shí)Vidal等發(fā)現(xiàn)上調(diào)H19可以促進(jìn)宮頸細(xì)胞對HPV的易感性[12]。因此H19基因可以作為宮頸癌早期復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。此外P21，UCA1和MALAT-1也被發(fā)現(xiàn)在癌組織中高表達(dá)，提示癌細(xì)胞復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能[13-15]。lncRNA芯片技術(shù)能快速高效地發(fā)現(xiàn)具有重要調(diào)控功能的lncRNA，逐漸成為lncRNA檢測重要手段，將有助于開發(fā)新的癌癥診斷和治療方法。

本研究中我們借助Arraystar公司的lncRNA芯片，在臨床中收集了20例宮頸癌組織和20例正常宮頸組織，分析兩組lncRNA表達(dá)譜的變化。發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中差異表達(dá)的lncRNA共22043條。其中11545條表達(dá)上調(diào)，10498條表達(dá)下調(diào)。mRNA共13982個(gè)出現(xiàn)差異性變化，5867個(gè)表達(dá)上升和7115個(gè)表達(dá)下降。上調(diào)mRNA(Fold>2)多與細(xì)胞膜成分相關(guān)，具有受體反應(yīng)和離子通道等分子功能，參與了刺激反應(yīng)，信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞交流等生物過程(圖2 A,B,C)；下調(diào)mRNA(Fold>2)與細(xì)胞膜細(xì)胞器成分相關(guān)，具有蛋白錨定和能量傳遞等功能，參與了核苷酸代謝，嘌呤代謝和核苷磷酸代謝等生物過程(圖2 D,E,F)，KEGG通路分析表明MAPK，p53，Ras和Wnt等信號(hào)通路很可能參與了mRNA的分子調(diào)控。很多研究證實(shí)，lncRNA的表達(dá)與mRNA表達(dá)水平具有密切關(guān)系，lncRNA能夠通過影響mRNA表達(dá)情況來發(fā)揮其功能。我們著重分析了表達(dá)差異最高的10條lncRNA和mRNA共差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)無論上調(diào)和下調(diào)顯著的lncRNA附近的功能性mRNA均有不同程度的表達(dá)上調(diào)和下調(diào)(Fold>2)，其中l(wèi)ncRNA RP11-534N16.1下調(diào)63倍對應(yīng)的mRNA DSG1下調(diào)61倍，為這10條lncRNA中下調(diào)的mRNA倍率最高，后續(xù)研究將會(huì)進(jìn)一步確定這兩者的關(guān)系。同時(shí)，我們通過熒光定量PCR隨機(jī)測定4個(gè)變化明顯的lncRNA(BC008359,RP11-521B24.5,BRE-AS1,和RP11-229P13.15)進(jìn)一步驗(yàn)證，也到相同的結(jié)論，提示這4個(gè)lncRNA在宮頸癌組織中可能發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于宮頸癌發(fā)病原因和機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)中，我們闡述了宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA的變化情況，并找出與宮頸癌關(guān)系最密切的lncRNA分子，為探討lncRNA參與宮頸癌發(fā)生與發(fā)展及治療提供分子依據(jù)，我們將進(jìn)一步對這些lncRNA進(jìn)行研究，以期闡明這些差異表達(dá)的IncRNA在宮頸癌中的作用，尋找宮頸癌治療的有效靶點(diǎn)。

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(編輯：吳小紅)

Different Expression Profiles of lncRNA in Cervical Cancer Tissues and Its Significance

CHENGantao,YANGXiao,CHENGYanxiang.

RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan，430060

Objective To investigate the changes of lncRNA in cervical cancer tissues,and provide molecular basis for investigating the occurrence and development of cervical cancer related with lncRNA.Methods 20 cervical cancer patients and 20 normal cervical tissues were selected.Applicated with high-through put microarray lncRNA,we tested the variation of lncRNA expression profiles of normal cervical tissues and cervical cancer tissues.The result was verified by real-time quantitative RT-PCR.Results Compared with normal cervical tissues,a total of 30586 lncRNA and 13982 mRNA were identified as differentially expressed in cervical cancer tissues.GO cluster analysis showed that up-regulated mRNAs and down-regulated mRNAs were associated with various biological processes respectively.The 10 lncRNA showed the most obvious difference analyzed to influence mRNA corresponding to exert its biological function.Quantitative PCR results were consistent with the microarray results suggested four lncRNA (BC008359,RP11-521B24.5,BRE-AS1,and RP11-229P13.15) played important roles in cervical cancer.Conclusion The changes of lncRNA in cervical cancer,and provide molecular basis for investigating the occurrence and development and the therapy of cervical cancer related with lncRNA.

Cervical cancer tissues;lncRNA;High-throughput microarray lncRNA

湖北省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(編號(hào):2012Z-Y02)；湖北省衛(wèi)計(jì)委一般面上項(xiàng)目(編號(hào):WJ2015MB084)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):81302273)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院(陳干濤，楊 瀟，程艷香)；430060 湖北省仙桃市第三人民醫(yī)院(陳干濤)

程艷香

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.001

R737.33

A

1001-5930(2017)04-0523-05

2016-05-20

2016-12-15)