劉 佳，秦留安，席少枝，劉 軍，王緒云，李曉琪，楊 潔，尹 彤

(解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100853)

維生素K循環(huán)是機(jī)體內(nèi)維生素K依賴性凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ)活化的重要通路，環(huán)氧型維生素K經(jīng)維生素K環(huán)氧化物還原酶(vitamin K epoxide reductase，VKOR，編碼基因VKORC1)轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素K，然后在VKOR的作用下，轉(zhuǎn)化為還原型維生素K，參與維生素K依賴性凝血因子的羧化反應(yīng)[1]。由于維生素K循環(huán)是通過少量維生素K的反復(fù)利用，實現(xiàn)維生素K的氧化還原和γ羧化，因此，肝臟維生素K循環(huán)中的維生素K含量的穩(wěn)態(tài)對凝血因子活化反應(yīng)的影響更直接和顯著。近年研究表明，在維生素K循環(huán)中，細(xì)胞色素P450家族的成員CYP4F2具有氧化水解維生素K的功能[1]，因此，CYP4F2有可能通過改變維生素K循環(huán)中維生素K含量的穩(wěn)態(tài)影響凝血因子的活化，從而發(fā)揮其對凝血功能的影響。我們前期針對維生素K拮抗劑華法林的藥物基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在維生素K代謝和循環(huán)通路上的候選基因(VKORC1、GGCX、CYP4F2、EPHX1、APOE、NQO1、CALU)中，只有CYP4F2基因變異型與華法林出血并發(fā)癥相關(guān)。經(jīng)校正維生素K攝取等臨床環(huán)境因素和已知相關(guān)基因變異因素(CYP2C9*3)后[2，3]，其中攜帶CYP4F2rs3093168 CC基因型患者發(fā)生嚴(yán)重出血并發(fā)癥的風(fēng)險是非攜帶者的7.61倍[4]，提示CYP4F2基因是影響華法林出血并發(fā)癥的重要相關(guān)基因，其作用機(jī)制可能與CYP4F2參與影響凝血因子的活化密切相關(guān)。盡管如此，目前尚未見CYP4F2對維生素K依賴性凝血因子活性影響的相關(guān)文獻(xiàn)報道。鑒于此，本研究以維生素依賴性凝血因子FⅨ活性的改變?yōu)槔ㄟ^在人肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞中過表達(dá)CYP4F2和凝血因子FⅨ，探討CYP4F2對維生素K依賴性凝血因子活化的影響，以期為基于藥物基因組學(xué)的維生素K拮抗劑個體化抗凝治療提供新的生物功能依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

攜帶人CYP4F2-cDNA的pCR4Zero質(zhì)粒[5]和攜帶人凝血因子FⅨ-cDNA的pIRES質(zhì)粒[6]分別由美國密西西比大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Stec教授和德國烏爾茨堡大學(xué)人遺傳學(xué)研究所Czogalla教授惠贈。人正常肝臟細(xì)胞系LO2細(xì)胞購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清及Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑為 Invitrogen 公司產(chǎn)品。XbaⅠ與SalⅠ核酸限制性內(nèi)切酶購自TAKARA公司。FⅨ抗體、CYP4F2抗體及FⅨa活性檢測試劑盒購自ABCAM公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

通過攜帶人CYP4F2-cDNA的pCR4Zero質(zhì)粒和攜帶人凝血因子FⅨ-cDNA的pIRES質(zhì)粒，構(gòu)建同時含有CYP4F2-cDNA片段與FⅨ-cDNA片段的pIRES質(zhì)粒。步驟如下：根據(jù)NCBI的CYP4F2基因CDS序列設(shè)計擴(kuò)增引物。上游引物 5’-tctagaatgtcccagctgagcctgtc-3’，下游引物5’-gtcgactcagctcaggggctccaccc-3’。以pCR4Zero-CYP4F2質(zhì)粒作為模板，PCR 擴(kuò)增CYP4F2基因 CDS 片段。反應(yīng)體系：DNA模板1.5 μl、taq Master Mix 12.5 μl、上下游引物各0.8 μl、ddH2O 9.4 μl。用2.0% 瓊脂糖凝膠電泳分離并回收PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增后的CYP4F2-cDNA片段連接到T載體。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氨芐青霉素(100 mg/ml) 的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取生長狀態(tài)良好的菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后使用XbaⅠ與SalⅠ核酸限制性內(nèi)切酶分別雙酶切pIRES-FⅨ-cDNA質(zhì)粒和連接CYP4F2-cDNA片段的T載體。使用T4連接酶16℃條件下將CYP4F2-cDNA片段連接到pIRES質(zhì)粒的MCS B區(qū)域 (此前pIRES質(zhì)粒的MCS A區(qū)域已經(jīng)包含F(xiàn)Ⅸ-cDNA片段)，構(gòu)建pIRES-FⅨ-cDNA質(zhì)粒。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氨芐青霉素(100 mg/ml) 的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取生長狀態(tài)良好的菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并測序鑒定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

使用含10%胎牛血清及5%雙抗的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)LO2細(xì)胞，常規(guī)換液、傳代。取生長狀態(tài)好的LO2細(xì)胞使用胰蛋白酶消化計數(shù)，將6×105細(xì)胞種植于直徑為6 cm的平皿中。用含10%胎牛血清及3 nmol/L維生素K1(維生素K1使用10倍DMSO稀釋后加入培養(yǎng)基)的1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞融合面積達(dá)70%～80%后，更換無血清無雙抗的1640培養(yǎng)基。將8 μg pIRES-FⅨ質(zhì)粒溶于500 μl Opti-mem無血清培養(yǎng)基中(A管)。另將20 μl Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑溶于500 μl Opti-mem無血清培養(yǎng)基中(B管)，室溫靜置 5 min 后將兩管混合搖勻，室溫孵育20 min后將混合液緩慢加入LO2細(xì)胞中，混勻后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同樣方法轉(zhuǎn)染pIRES-FⅨ-CYP4F2 質(zhì)粒以及pIRES空白對照質(zhì)粒。每組質(zhì)粒做復(fù)孔同步轉(zhuǎn)染。5 h后更換新的含10%胎牛血清及3 nmol/L維生素K1的1640培養(yǎng)基。48 h后收集培養(yǎng)上清于-80℃保存。

1.4 蛋白免疫印跡

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，分別刮取各組細(xì)胞，加入RIPA高效細(xì)胞裂解液。小心吸取上清提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒 (Solarbio, 中國) 進(jìn)行蛋白定量。分別將各組蛋白加入1/4體積的蛋白上樣緩沖液后置于沸水中煮5 min加樣，每組蛋白上樣30 μg。SDS-PAGE 凝膠電泳 100 V、 1.5 h、半干轉(zhuǎn)法將凝膠蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜條件：恒流300 mA，2 h。使用5% 脫脂奶粉37℃封閉1 h。將目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶剪開，兩張含有目的蛋白的膜分別加入1∶1000稀釋的FⅨ 抗體以及1∶1000稀釋的CYP4F2 抗體，含有內(nèi)參蛋白的膜加入1∶1000稀釋的GAPDH內(nèi)參抗體(Solarbio,中國)，置于4℃冰箱過夜。TBST 洗膜10 min，共3次。然后分別加入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體 (Solarbio,中國)，37℃孵育1 h。再次 TBST 洗膜10 min，共3次。用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑 (Solarbio, 中國) 放射自顯影檢測FⅨ和CYP4F2蛋白表達(dá)。

1.5 凝血因子活性檢測

根據(jù)FⅨa Assay檢測試劑盒說明書，將每組蛋白裂解液各取10 μg 分別加入96孔板中，然后分別加入10 μl 配制好的master mix溶液，加入FⅨa Assay Buffer 溶液至98 μl，混勻后37℃孵育15 min。每個孔中加入2 μl FⅨa substrate-AMC 溶液，混勻。避光37℃孵育30 min后放入熒光酶標(biāo)儀(Ex/Em=360/450 nm)。將每組細(xì)胞培養(yǎng)上清各取10 μl加入96孔板中，同樣的方法對細(xì)胞培養(yǎng)上清中FⅨa活性進(jìn)行檢測。以上檢測各組樣本均做復(fù)孔重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PCR 擴(kuò)增目的基因和構(gòu)建質(zhì)粒

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳30 min后可得到一條大小約1700 bp的擴(kuò)增條帶(圖1A)，與 NCBI 中CYP4F2基因 CDS 大小一致，提示成功克隆CYP4F2基因。pIRES-FⅨ-CYP4F2質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ與SalⅠ核酸限制性內(nèi)切酶雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳50 min后可獲得1條大約1700 bp條帶(圖1B)，與NCBI中CYP4F2基因CDS大小一致，測序后證實含有CYP4F2-cDNA片段，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染pIRES-FⅨ質(zhì)粒以及pIRES-FⅨ-CYP4F2質(zhì)粒后，F(xiàn)Ⅸ和CYP4F2的表達(dá)顯著增加 (P<0.05；圖2)，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并正常表達(dá)。

2.3 凝血因子活性檢測

使用FⅨa活性檢測試劑盒以及熒光酶標(biāo)儀對各組細(xì)胞裂解液及培養(yǎng)上清FⅨa進(jìn)行定量分析。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FⅨ后LO2細(xì)胞FⅨa的活性較正常對照組明顯升高[培養(yǎng)上清：(2268.67±114.15)vs(1614.00±69.67)，P=0.038；細(xì)胞裂解液：(1097.33±55.52)vs(778.67±36.01)，P=0.041]。提示細(xì)胞中FⅨa的活性與FⅨ表達(dá)呈正相關(guān)。而同時過表達(dá)CYP4F2和FⅨ后LO2細(xì)胞FⅨa的活性較過表達(dá)FⅨ組明顯降低[培養(yǎng)上清：(1540.00±72.64)vs(2268.67±114.15)，P=0.032；細(xì)胞裂解液：(1805.33±10.50)vs(1097.33±55.52)，P=0.036]。提示維生素K代謝相關(guān)基因CYP4F2過表達(dá)對凝血因子的活化具有抑制作用，進(jìn)一步對凝血產(chǎn)生影響。具體結(jié)果見圖3。

圖1 CYP4F2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pIRES-FⅨ-CYP4F2重組質(zhì)粒酶切

Figure 1 Electrophoresis of CYP4F2 PCR product and enzyme cleave identification of recombinant plasmid

M1: D2000 DNA marker; 1: PCR product; M2: 1kb plus DNA marker; 2: pIRES-FⅨ-CYP4F2 plasmid cleaved byXbaⅠ/SalⅠ; 3: pIRES-FⅨ-CYP4F2 plasmid

圖2 各組LO2細(xì)胞FⅨ及CYP4F2蛋白表達(dá)Figure 2 FⅨ and CYP4F2 protein expression of different LO2 cells Control: empty plasmid (pIRES); FⅨ: recombinant plasmid (pIRES- FⅨ); CYP4F2+FⅨ: recombinant plasmid (pIRES-FⅨ-CYP4F2). Compared with control group, *P<0.05

圖3 各組LO2細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)上清液中FⅨa定量分析Figure 3 Quantitative analysis of FⅨa in cell culture supernatant and lysis solution from different plasmids

A: cell supernatant; B: cell lysates. Control: empty plasmid (pIRES); FⅨ: recombinant plasmid (pIRES-FⅨ); CYP4F2+FⅨ: recombinant plasmid (pIRES-FⅨ-CYP4F2); RFU: relative fluorescence units. Compared with control group,*P<0.05

3 討 論

CYP4F2基因是CYP450超家族的成員之一，位于19號染色體短臂，全長約20 kb，由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成[7]。CYP4F2編碼的蛋白具有氧化水解維生素K的功能，通過羥基化維生素K苯基側(cè)鏈導(dǎo)致維生素K循環(huán)中還原型維生素K水平下降[1]。CYP4F2基因突變后對維生素K的代謝能力改變，造成維生素K蓄積或減少。多個研究表明CYP4F2*3基因型與華法林高劑量有關(guān)[8，9]。但CYP4F2與出血并發(fā)癥的相關(guān)性及作用機(jī)制研究相對較少。本研究通過在人肝細(xì)胞中過表達(dá)CYP4F2和FⅨ后發(fā)現(xiàn)，CYP4F2對維生素K依賴性凝血因子的活化具有抑制作用。該研究表明，CYP4F2的過表達(dá)可能增強(qiáng)了對維生素K循環(huán)中維生素K的氧化水解，導(dǎo)致還原型維生素K含量降低，進(jìn)而導(dǎo)致凝血因子γ羧化反應(yīng)減弱，凝血因子活性降低。由于經(jīng)肝臟維生素K循環(huán)進(jìn)行的凝血因子γ羧化反應(yīng)的變化與維生素K拮抗劑華法林出血并發(fā)癥的發(fā)生直接相關(guān)，因此，本研究為前期發(fā)現(xiàn)的CYP4F2基因變異型與華法林出血并發(fā)癥的關(guān)聯(lián)性提供了生物功能依據(jù)[4，10]。

本研究通過補(bǔ)充外源性維生素K1使細(xì)胞培養(yǎng)液中維生素K1濃度達(dá)到3 nmol/L，該濃度與人血漿中維生素K濃度接近[11，12]，因此，既能保證細(xì)胞完成正常的維生素K循環(huán)，又能避免外源性維生素對實驗造成的干擾。由于FⅨ是分泌蛋白，因此本研究分別采用細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為樣本檢測FⅨa的活性。結(jié)果顯示，無論是在細(xì)胞裂解液還是細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，過表達(dá)CYP4F2后，F(xiàn)Ⅸa的活性均降低。另外，在肝細(xì)胞的維生素K循環(huán)中VKOR為關(guān)鍵酶[5]，在維生素K的氧化還原過程中發(fā)揮重要作用。本研究在細(xì)胞培養(yǎng)過程中未額外轉(zhuǎn)染外源性VKOR，而是依靠細(xì)胞內(nèi)源性VKOR完成維生素K循環(huán)及凝血因子羧化反應(yīng)。這樣可能存在因細(xì)胞內(nèi)源性VKOR活性不足而影響結(jié)果，但是通過對維生素K依賴性凝血因子活性的檢測發(fā)現(xiàn)，依靠肝細(xì)胞內(nèi)源性VKOR能夠?qū)崿F(xiàn)維生素K循環(huán)催化的凝血因子羧化反應(yīng)。

綜上所述，本研究證實在肝細(xì)胞中過表達(dá)CYP4F2可導(dǎo)致維生素K依賴性FⅨa的活性降低。該結(jié)果將有助于進(jìn)一步揭示CYP4F2基因與維生素K拮抗劑華法林出血關(guān)聯(lián)性的相關(guān)功能機(jī)制。

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