何曉樂，王曉明，葛 偉，李 榕，王 琳，王 寧，許 榮，賈 新，劉 軍，2*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科，西安 710032；2蘭州軍區(qū)總蘭州醫(yī)院全軍骨科研究所，蘭州 730000)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而對未折疊或錯誤折疊蛋白和其他損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的一種自我保護反應(yīng)[1]。ERS發(fā)生后，未折疊蛋白反應(yīng)可引起一系列的細(xì)胞反應(yīng)，持續(xù)或者急性ERS可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯或細(xì)胞凋亡[2]。人類多種疾病的發(fā)生，如代謝紊亂疾病、神經(jīng)變性疾病、炎性疾病和癌癥等，都與ERS信號傳導(dǎo)失調(diào)相關(guān)。研究表明，ERS參與多種細(xì)胞調(diào)節(jié)過程，如氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、自身免疫等。Fu等[3]的研究表明，金屬硫蛋白可通過調(diào)節(jié)ERS來降低心肌細(xì)胞對阿霉素敏感性及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的釋放，從而抑制阿霉素對心肌的損傷作用。Ceylan-lsik等[4]通過老年C57BL小鼠試驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素-1通過ERS可上調(diào)鋅指轉(zhuǎn)錄因子(GATA binding factor-4，GATA-4)、心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、自噬體蛋白P62，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+及自噬標(biāo)志物胰島β細(xì)胞自噬相關(guān)基因1(islet β cell autophagy related gene 1，Beclin-1)、自噬相關(guān)基因5(autophagy related gene 5,ATG5)、ATG7等，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和心臟間質(zhì)纖維化。內(nèi)脂素(visfatin)是Fukuhara等[5]發(fā)現(xiàn)的由一種脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，已證實重組內(nèi)脂素可以劑量依賴形式產(chǎn)生炎癥因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin1β)、IL-6、IL-10等，也可成為CD14+單核細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞的潛在趨化因子。研究發(fā)現(xiàn)，visfatin濃度為1×10-5mol/L時對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的影響最為明顯[6]。本研究采用姜黃素(curcumin，Cur)干預(yù)visfatin誘導(dǎo)的 HUVECs損傷，探討Cur改善內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

HUVECs細(xì)胞株及MTT酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(第四軍醫(yī)大學(xué)免疫教研室)，細(xì)胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、需肌醇激酶/核酸內(nèi)切酶1(inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease-1，IRE1)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78)一抗(江蘇：碧云天生物技術(shù)研究所)；HRP羊抗鼠IgG二抗、siRNA、IRE1ɑ siRNA、二甲基亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO)、胰蛋白酶、visfatin及Cur(Sigma公司，美國)；低糖DMEM(dulbecco modified eagle medium)細(xì)胞培養(yǎng)基(HycLone公司，美國)；小牛血清(四季青公司，杭州)；RPMI-1640(roswell park memorial institute-1640)培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國)；細(xì)胞裂解液(碧云天公司，上海)。

1.2 HUVECs的培養(yǎng)

用含10%小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d，之后用0.25%胰蛋白酶進行消化。鏡下觀察到細(xì)胞收縮變圓時棄去消化液，加入培養(yǎng)液以終止胰蛋白酶的作用。用滴管吹打壁上的細(xì)胞，使其完全脫落并分離，根據(jù)實驗需要按不同濃度接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。

1.3 細(xì)胞分組及MTT法檢測HUVECs活力

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×105mol/ml濃度接種于多聚賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，24 h內(nèi)細(xì)胞達80%～90%融合，用含0.01%磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，使細(xì)胞同步化。接種時分為4組： (1)正常對照組HUVECs在培養(yǎng)液中孵育 24 h；(2)visfatin組HUVECs在加入1×10-5mol/L visfatin的培養(yǎng)液中以2×105mol/ml濃度孵育24 h；(3)HUVECs在加入1×10-5mol/Lvisfatin和10 μmol/L Cur的培養(yǎng)液中孵育24 h；(4)HUVECs在加入1×10-5mol/L visfatin和 20 μmol/L Cur的培養(yǎng)中孵育24 h。每組按實驗要求分別重復(fù)8孔。各組細(xì)胞孵育8 h后，棄去培養(yǎng)液，加入100 μl DMEM培養(yǎng)液和含0.5%的10 μl培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入100 μl DMSO原液，振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后拍照，酶標(biāo)儀檢測吸光度A值(λ=492 nm)，記錄結(jié)果，實驗重復(fù)3次。

1.4 ELISA 法檢測單核細(xì)胞趨化因子和E-選擇素

HUVECs 以2×105mol/ml濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，實驗分組同上，將稀釋好的包被抗體加入ELISA板，100 μl/孔，4℃放置48 h。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min。各組分別加待檢樣品100 μl/孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后洗滌。于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的HRP羊抗鼠IgG二抗(經(jīng)滴定后的稀釋度)100 μl/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育0.5～1 h，洗滌。于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的3’, 3’, 5’, 5’, -四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)底物溶液100 μl/孔，37℃下處理10～30 min。 在ELISA檢測儀上，調(diào)至45 0nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)及E-選擇素(E-selectin)的含量。

1.5 Western blotting測定IRE1、GRP78和ICAM-1蛋白表達

棄去培養(yǎng)液，使用預(yù)冷PBS輕輕漂洗一遍，隨即加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑以裂解細(xì)胞。收集各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，補上樣緩沖液使總體積為80 μl，再加100 μl溴酚藍(lán)染液煮沸4 min。然后各取10 μl樣品，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophresis，SDS-PAGE)進行分離，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，洗膜，加入1∶600稀釋的抗ICAM-1、IRE1及GRP78的抗體，4℃過夜，用洗膜液漂洗后加入1∶5000稀釋的二抗，搖床1 h，TBST(Tris-Buffer Solution Tween)沖洗3遍，每次5 min，加ECL熒光液顯色，上機檢測。用目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶(β-actin)積分吸光度值(integrated absorbance，IA)比值的百分率表示所檢測蛋白的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測HUVECs 活力結(jié)果

MTT檢測結(jié)果表明，與正常組相比，HUVECs單純給予1×10-5mol/L visfatin或給予1×10-5mol/Lvisfatin與不同濃度的Cur聯(lián)合處理24 h后，細(xì)胞活力沒有明顯變化。相比對照組和visfatin組，不同濃度Cur組(10、20 μmol/L)的HUVECs 細(xì)胞活力未降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 Cur對visfatin誘導(dǎo)的HUVECs MCP-1和E-selectin含量的影響

與正常對照組相比，HUVECs給予1×10-5mol/Lvisfatin處理24 h后，HUVECs的MCP-1和E-selectin含量升高；而當(dāng)給予10 μmol/L Cur和20 μmol/L Cur處理后，可顯著降低HUVECs 的MCP-1和E-selectin含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖1)，提示Cur可抑制visfatin誘導(dǎo)的HUVECs 的MCP-1和E-selectin含量的增加(圖1)。

2.3 Cur對visfatin誘導(dǎo)的HUVECs ICAM-1、IRE1和GRP78表達的影響

與正常對照組相比，HUVECs給予visfatin處理24 h后，ICAM-1、IRE1和GRP78表達增加。而給予10 μmol/L和20 μmol/L Cur處理后，顯著降低ICAM-1、IRE1和GRP78表達。提示Cur可通過減少ICAM-1、IRE1和GRP78的表達從而減輕visfatin誘導(dǎo)的HUVECs損傷(圖2)。

圖1 Cur對visfatin誘導(dǎo)的HUVECs MCP-1和E-selectin含量的影響Figure 1 Effect of Cur on MCP-1 and E-selectin production of the HUVECs induced by visfatin 1: Control group; 2: visfatin 1×10-5mol/L group; 3: visfatin 1×10-5mol/L+Cur 10 μmol/ml group; 4: visfatin 1×10-5mol/L+ Cur 20 μmol/ml group; HUVECs: human umbilical vein endothelial cells; MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1. Compared with control group,*P<0.05; compared with visfatin group,#P<0.05; compared with Cur group,△P<0.05

3 討 論

ERS及相應(yīng)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)貫穿整個細(xì)胞周期。UPR主要通過以下3 種感受蛋白發(fā)揮作用：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、活化轉(zhuǎn)錄因子-6和IRE1。UPR發(fā)生時，IREl腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域與GRP78解離，IRE1寡聚化引起自身磷酸化，從而激活許多與免疫、炎癥和調(diào)亡相關(guān)的蛋白激酶。Hong等[7]發(fā)現(xiàn)IRE1ɑ/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)途徑參與氧化低密度脂蛋白及其脂質(zhì)氧化產(chǎn)物7-酮基膽固醇和4-羥基壬烯醛誘導(dǎo)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)形成。β受體阻滯劑體內(nèi)和體外研究表明， 它可通過抑制ERS反應(yīng)減輕細(xì)胞凋亡，并改善心肌肥大和心力衰竭問題[8]。體內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，膜穩(wěn)定劑(鈉離子通道阻滯劑)亦能通過減輕ERS反應(yīng)減少細(xì)胞凋亡，從而改善模型動物的心功能。Herzog等[9]發(fā)現(xiàn)，氧化低密度脂蛋白可通過修飾抑制蛋白二硫鍵異構(gòu)酶，進而誘導(dǎo)ERS反應(yīng)，引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。兔AS模型研究表明，高濃度同型半胱氨酸可誘導(dǎo)產(chǎn)生UPR，內(nèi)皮細(xì)胞中C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein)表達及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與斑塊大小呈正相關(guān)[10]。

圖2 Cur對visfatin誘導(dǎo)的HUVECs ICAM-1、IRE1和GRP78表達的影響Figure 2 Effect of Cur on ICAM-1, IRE1 and GRP78 expression in the HUVECs induced by visfatin

1: control group; 2: visfatin 1×10-5mol/L group; 3: visfatin 1×10-5mol/L+Cur 10μmol/mL group; 4: visfatin 1×10-5mol/L+Cur 20 μmol/ml group. HUVECs: human umbilical vein endothelial cells; ICAM-1: intercellular adhesion molecule-1; IRE1: inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease-1; GRP78: glucose-regulated protein 78. Compared with control group,*P<0.05; compared with visfatin group,#P<0.05; compared with Cur group,△P<0.05

具有前炎癥作用的visfatin能促進AS進程[11]。體外研究表明: visfatin通過增加細(xì)胞內(nèi)的ICAM-1、血管黏附分子-1(vascular adhesion molecule，VCAM-1)、E-selectin及IL-6和IL-8的表達而誘使白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞[12]。visfatin可促進機體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，活化多種因子如成纖維細(xì)胞生長因子-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-2和9等[13]。Sahebkar等[14]報道，在AS及急性心肌梗死的活動斑塊破裂處visfatin含量明顯增高，提示其可導(dǎo)致斑塊失穩(wěn)。在臨床研究中，冠狀動脈硬化綜合征患者血清visfatin含量明顯增高。我們前期研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷和visfatin呈濃度依賴性，當(dāng)visfatin 為1×10-5mol/L時，損傷程度最高。

Cur是從姜黃屬中藥塊莖中提取出來的一種酚性色素，經(jīng)濟安全、副反應(yīng)小且毒性低。目前已證實Cur具有如下功能：(1)具有酚及β-二酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其酚性羥基可結(jié)合或清除自由基，從而發(fā)揮抗氧化特性；(2)可在機體內(nèi)增加載脂蛋白A含量，通過促進高密度脂蛋白膽固醇代謝和降低載脂蛋白B含量，降低低密度脂蛋白膽固醇-C的水平，從而達到降脂目的；(3)降低體內(nèi)C反應(yīng)蛋白、結(jié)合珠蛋白及IL-1β水平，提高一氧化氮水平，其可作為抑制劑拮抗花生四烯酸代謝中的環(huán)氧酶和脂氧酶，減少前列腺素D2、E2、F2a及白三烯等促炎癥因子的釋放；(4)通過下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子-κB活性，干擾蛋白激酶C信號傳導(dǎo)，直接或間接抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

本研究采用前期研究摸索出的visfatin的濃度作用于HUVECs，建立實驗組后，加入不同濃度Cur，MTT法結(jié)果表明細(xì)胞活力未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明Cur對HUVECs生長活性無抑制和毒性作用。后期實驗結(jié)果表明，與visfatin組相比，HUVECs給予10 μmol/L和20 μmol/L Cur的處理后，MCP-1、E-selectin等炎癥指標(biāo)含量下降，同時Cur可下調(diào)ICAM-1、IRE1、GRP78的表達，且濃度為20 μmol/L時作用最顯著。分析其機制，可能為：(1)Cur分子中的2個苯丙烯酰基骨架、苯環(huán)上的酚羥基和甲氧基及丙烯基與β-雙酮/烯醇式結(jié)構(gòu)的連接有助于其發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，其中甲氧基的存在進一步增加其抗氧化活性[15]；(2)Cur通過直接抑制微粒體的前列腺素E2合酶-1阻斷PGE2的生物合成，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)節(jié)液態(tài)氧和環(huán)氧化酶2[16]；(3)Cur具有抑制MCP-1激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、釋放溶菌酶、上調(diào)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞黏附分子和IL-1、IL-6水平的作用；(4)Cur可通過過氧化物酶產(chǎn)生苯氧基團，協(xié)同氧化細(xì)胞內(nèi)谷胱苷肽或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADH),通過攝入O2形成ROS[17]。

綜上所述，ERS可能參與visfatin誘導(dǎo)的HUVECs炎癥損傷過程，Cur可抑制visfatin的作用，對內(nèi)皮細(xì)胞具有保護功能，其機制可能與抑制ERS相關(guān)。本研究為我們將來更好地研究Cur的作用效果和ERS在血管內(nèi)皮損傷中的機制提供初步依據(jù)，但它們之間是否涉及其他信號傳導(dǎo)通路尚需進一步研究。

【參考文獻】

[1] Marí M, Morales A, Colell A,etal. Mitochondrial cholesterol accumulation in alcoholic liver disease: role of ASMase and endoplasmic reticulum stress[J]. Redox Biol, 2014, 3: 100-108. DOI: 10.1016/j.redox.2014.09.005.

[2] Wang G, Liu K, Li Y,etal. Endoplasmic reticulum stress mediates the anti-inflammatory effect of ethyl pyruvate in endothelial cells[J].PLoS One, 2014, 9(12): e113983. DOI: 10.1371/journal.pone.0113983.

[3] Fu Z, Guo J, Jing L,etal. Enhanced toxicity and ROS generation by doxorubicin in primary cultures cardiomyocytes from neonatal metallothionein-Ⅰ/Ⅱ null mice[J].ToxicolinVitro, 2010, 24(6): 1584-1591. DOI: 10.1016/j.tiv.2010.06.009.

[4] Ceylan-lsik AF,Dong M,Zhang Y,etal. Cardiomyocyte-specific deletion of endothelin receptor A rescues aging-associated cardiac hypertrophy and contractile dysfunction: role of autophagy[J].Basic Res Cardiol, 2013, 108(2): 335. DOI: 10.1007/s00395-013-0335-3.

[5] Fukuhara A, Matsuda M, Nishizawa M,etal. visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J]. Science, 2005, 307(5708): 426-430. DOI: 10.1126/science.1097243.

[6] 何曉樂, 劉 軍, 張航向, 等. TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)吡格列酮在內(nèi)脂素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷過程中作用機制的探討[J].中華老年多器官疾病雜志, 2015, 14(4): 301-306. DOI: 10.i1915/j.issn.1671-5403.2015.04.06.

He XJ, Liu J, Zhang HX,etal.TLR4/NF-κB signal pathway mediates pioglitazone protecting human vascular endothelial cells against visfatin-induced injury[J]. Chin J Mult Organ Dis Elerly, 2015, 14(4):301-306. DOI: 10.i1915/j.issn.1671-5403.2015.04.06.

[7] Hong S, Gu Y, Gao Z,etal. EGFR inhibitor-driven endoplasmic reticulum stress-mediated injury on intestinal epithelial cells[J].Life Sci, 2014, 119(1-2): 28-33. DOI: 10.1016/j.lfs.2014.10.008.

[8] Breckwoldt MO, Chen JW, Stangenberg L,etal. Tracking the inflammatory response in strokeinvivoby sensing the enzyme myeloperoxidase[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(47): 18584-18589. DOI: 10.1073/pnas.0803945105.

[9] Herzog DP, Dohle E, Bischoff I,etal. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts[J].Biomed Res Int, 2014, 2014: 320123. DOI: 10.1155/2014/320123.

[10] Lu H, Lu L, Xu ZC,etal. Tauroursodeoxycholic acid and 4-phenyl butyric acid alleviate endoplasmic reticulum stress and improve prognosis of donation after cardiac death liver transplantation in rats[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2014, 13(6):586-593. DOI: 10.1016/S1499-3872(14)60269-1.

[12] Hognogi LD, Simiti LV.The cardiovascular impact of visfatin — an inflammation predictor biomarker in metabolic syndrome[J]. Clujul Med, 2016, 89(3): 322-326.DOI: 10.15386/cjmed-591.

[14] Sahebkar A, Giorgini P, Ludovici V,etal. Impact of statin therapy on plasma resistin and visfatin concentrations: a systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials[J]. Pharmacol Res, 2016, 111: 827-837. DOI: 10.1016/j.phrs.2016.07.031.

[15] Lewis JD, Ferrara A, Peng T,etal. Risk of bladder cancer among diabetic patients treated with Cur: interim report of a longitudinal cohort study[J]. Diabetes Care, 2011, 34(4): 916-922. DOI: 10.2337/dc10-1068.

[16] Sato K, Awasaki Y, Kandori H,etal. Suppressive effects of acid-forming diet against the tumorigenic potential of Cur hydrochloride in the urinary bladder of male rats[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2011, 251(13): 234-244. DOI: 10.1016/j.taap.2011.01.006.

[17] Yang X, Chan JC. Comment: analyses using time-dependent pioglitazone usage in Cox models may lead to wrong conclusions about its association with cancer[J]. Diabetes Care, 2011, 34(8): 136-137. DOI: 10.2337/dc11-0627.