趙鐵梅，楊曉丹，蘇憲靈

(解放軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100853)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性發(fā)作和機(jī)械通氣相關(guān)肺炎(ventilator associated pneumonia，VAP)是常見的與生物被膜相關(guān)的呼吸道感染性疾病，銅綠假單胞菌為常見致病菌[1,2]。雖然銅綠假單胞菌在COPD 和VAP中都可以形成導(dǎo)致治療困難的生物被膜，但COPD和VAP的疾病特點(diǎn)和發(fā)病情況各有差異：COPD 常呈慢性過(guò)程，而VAP常常為急性發(fā)病。那么，銅綠假單胞菌在這些感染中的生物學(xué)特性是否不同呢？綠膿菌素和彈性蛋白酶是銅綠假單胞菌重要的毒力因子，與肺部感染密切相關(guān)，那么，銅綠假單胞菌在COPD和VAP中的毒力是否也不同呢？為解決上述疑問(wèn)，我們收集了COPD和VAP患者呼吸道標(biāo)本分離得到的銅綠假單胞菌進(jìn)行細(xì)菌生物被膜形成能力和主要毒力因子的檢測(cè)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2012年1月至2014年3月解放軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的COPD急性發(fā)作和VAP患者(>60歲)的呼吸道標(biāo)本(合格痰標(biāo)本、經(jīng)氣道吸引物、肺泡灌洗液)分離得到的銅綠假單胞菌共 48株。除外COPD患者發(fā)生VAP期間分離到的菌株。分為兩組：COPD組(n=22)和VAP組(n=26)。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 主要試驗(yàn)儀器為比濁儀(bioMerieux公司，法國(guó))和RT-6000全自動(dòng)酶標(biāo)儀(雷杜公司，美國(guó))。胰酶大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)和MH肉湯(Muller-Hinton broth，MHB)均購(gòu)自美國(guó)BD公司，結(jié)晶紫購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，彈性蛋白酶-剛果紅購(gòu)自Sigma公司，0.1 mol/L Tris-HCl/l mmol/L CaCl2緩沖液購(gòu)自Promega公司，甲醇、乙醇、蛋白胨、硫酸鉀、氯化鎂、無(wú)水氯化鈣、三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。6孔聚苯乙烯平板購(gòu)自美國(guó)Costar公司。

1.2.2 銅綠假單胞菌生物被膜形成能力的檢測(cè) 參照Stepanovic等[3]的方法檢測(cè)生物被膜的生成能力。銅綠假單胞菌在TSB中隔夜培養(yǎng)18 h，次日用TSB配制0.5 McFarland菌懸液，稀釋至1.5×106CFU/ml，接種于96孔聚苯乙烯平板(0.2 ml)，TSB做陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h后，用250 μl無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗3次，99%甲醇固定后1%的結(jié)晶紫染色20 min，95%的乙醇作用10 min，吸出溶液至另一塊96孔聚苯乙烯平板，酶標(biāo)儀570 nm下檢測(cè)吸光度(absorbance,A)值。重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。參照Stepanovic等[4]的標(biāo)準(zhǔn)判斷生物被膜的生成能力：臨界值(ODc)=陰性對(duì)照平均值+(3×陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)差)。OD≤ODc：無(wú)生物被膜生成(-)；ODc4×ODc：生物被膜生成能力強(qiáng)(+++)。

1.2.3 綠膿菌素檢測(cè)[5]細(xì)菌在LB培養(yǎng)液(950 ml去離子水+胰化蛋白胨10 g+酵母提取物5 g+氯化鈉10 g)中培養(yǎng)16 h，離心后收集菌體，用新鮮PB培養(yǎng)液(含2%蛋白胨、1%硫酸鉀和0.14%氯化鎂)洗滌，懸浮,A600 nm=0.05，繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h后，用新鮮PB培養(yǎng)液稀釋至A600 nm=0.05。于新鮮PB培養(yǎng)液加入5 ml 細(xì)菌懸液，37℃恒溫培養(yǎng)箱200轉(zhuǎn)/min振蕩孵育24 h。取上述細(xì)菌懸液5 ml加入3 ml氯仿，振蕩混勻，靜置15～30 min，再以12 000 g離心20 min，將氯仿層轉(zhuǎn)入新試管，加入1 ml 0.2 mol/L的鹽酸，輕輕振蕩混勻，靜置15 min，取上層紅色水相100 μl，在520 nm處測(cè)A值。計(jì)算綠膿菌素濃度(μg/ml)=A520 nm×17.072。

1.2.4 彈性蛋白酶活性的測(cè)定[6]挑取新鮮生長(zhǎng)的菌落接種于2 ml PTSB液體培養(yǎng)基(每1000 ml雙蒸水中加人蛋白胨50 g、TSB 2.5 g，高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后置于4℃冰箱備用)中過(guò)夜增菌，比濁儀稀釋至菌懸液為105CFU/ml，加入2 ml菌懸液于18 ml PTSB培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)4 h。10 000 g 4℃離心15 min后，吸取上清液，用一次性濾器(0.45 μm)過(guò)濾除菌。15 ml振蕩培養(yǎng)管中加入20 mg彈性蛋白-剛果紅和1 ml反應(yīng)緩沖液 (0.1 mol/L Tris-HCl/1 mmol/L CaCl2，pH 7.2)，之后加入 1.0 ml細(xì)菌培養(yǎng)物的過(guò)濾上清液，在37℃、250轉(zhuǎn)/min振蕩條件下恒溫振蕩反應(yīng)18 h后，加入0.l ml 0.12 mol/L的乙二胺四乙酸終止反應(yīng)，將反應(yīng)物置于冰上。通過(guò)10 000 g 4℃離心20 min去除不可溶的彈性蛋白酶-剛果紅，取上清。在495 nm處讀取A值。背景A值為未加彈性蛋白酶-剛果紅時(shí)的A495 nm值，酶-底物反應(yīng)的A值減去背景A值，即為最終的A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用STATA 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般資料

COPD組和VAP組獲取呼吸道標(biāo)本距離發(fā)病的時(shí)間分別為(7.3±5.3)d和(3.1±2.6)d，入院前90 d內(nèi)應(yīng)用過(guò)抗菌藥物治療者分別占54.5%(12/22)和84.6%(22/26)，兩組患者均進(jìn)行了抗菌藥物治療，應(yīng)用具有抗假單胞菌活性藥物者分別占90.9%(20/22)和100.0%(26/26)，療程分別為(10.6±4.9)d和(16.4±7.7)d。COPD組患者入院前90 d內(nèi)有住院史者達(dá)45.5%(10/22)，近1年急性發(fā)作≥1次者占68.2%(15/22)。VAP組患者存在基礎(chǔ)疾病者占69.2%(18/26)，合并冠心病和(或)高血壓病者占46.2%(12/26)，合并腦部疾病者占42.3%(11/26)。

2.2 兩組生物被膜形成能力比較

各個(gè)菌株生物被膜形成能力差異較大，依據(jù)所得A值分為4個(gè)級(jí)別：無(wú)生物被膜生成(-)，生物被膜生成能力較弱(+)，生物被膜生成能力中等(++)和生物被膜生成能力強(qiáng)(+++)。兩組生物被膜形成能力的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表1)。

2.3 兩組綠膿菌素含量比較

各個(gè)菌株產(chǎn)生的綠膿菌素含量差異較大，按照檢測(cè)量分為4個(gè)數(shù)量級(jí)：<2，2～4，4～6和>6 μg/ml，結(jié)果顯示，兩組綠膿菌素含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.824；表2)。

2.4 兩組彈性蛋白酶含量比較

各個(gè)菌株產(chǎn)生的彈性蛋白酶含量差異較大，按照檢測(cè)A495 nm值分為3個(gè)數(shù)量級(jí)：<0.1，0.1～0.6和>0.6，結(jié)果顯示，兩組彈性蛋白酶含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.967；表3)。

3 討 論

銅綠假單胞菌是呼吸系統(tǒng)感染的常見分離菌，研究顯示：4%～15% COPD 患者的呼吸道標(biāo)本中可以分離到銅綠假單胞菌，約28.7%～34.7%的重度COPD急性發(fā)作是由銅綠假單胞菌所致[7,8]；26%的VAP是由銅綠假單胞菌所致[9]。雖然銅綠假單胞菌在COPD 和VAP中都可以形成生物被膜，但COPD和VAP的致病特點(diǎn)各有差異。在COPD患者中，銅綠假單胞菌常常由普通型轉(zhuǎn)變?yōu)轲ひ盒?，長(zhǎng)期定植在呼吸道，形成生物被膜，很難清除，一旦被膜內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)為足量游離菌或獲得新的感染細(xì)菌，即會(huì)引起急性發(fā)作，感染呈慢性過(guò)程。相反，在VAP中，由于吸引操作及呼吸氣流的剪切力使氣管插管上的生物被膜解離，細(xì)菌播散到下呼吸道，常常引起急性感染，氣管插管上的生物被膜細(xì)菌成為VAP的巨大致病菌儲(chǔ)存庫(kù)[10]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)引起上述感染的銅綠假單胞菌的生物學(xué)特性研究較少，病例數(shù)也較少。西班牙學(xué)者M(jìn)artínez-Solano等[11]研究了13例 COPD急性發(fā)作分離到的銅綠假單胞菌，結(jié)果顯示：與重癥監(jiān)護(hù)病房中血培養(yǎng)分離到的菌株相比，銅綠假單胞菌可以在某些COPD患者呼吸道中長(zhǎng)期存在，在此過(guò)程中細(xì)菌形態(tài)可以發(fā)生變化，生物被膜形成能力增加但毒力下降。美國(guó)學(xué)者Fricks-Lima等[12]比較了6例VAP患者和3例肺囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)患者分離到的銅綠假單胞菌的生物被膜形成能力，結(jié)果顯示各個(gè)VAP患者中分離到的銅綠假單胞菌生物被膜形成能力均較強(qiáng)， 顯著高于CF患者。但國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚無(wú)銅綠假單胞菌在COPD 和VAP中生物被膜形成能力和細(xì)菌毒力對(duì)比的報(bào)道。我們針對(duì)此方面進(jìn)行的研究結(jié)果顯示： COPD組與VAP組相比，銅綠假單胞菌的生物被膜形成能力無(wú)顯著性差異；但各組的細(xì)菌生物被膜形成能力存在個(gè)體差異。

表1 兩組銅綠假單胞菌生物被膜形成能力比較

-: non biofilm formation abilities; +: weak biofilm formation abilities; ++: moderate biofilm formation abilities; +++: strong biofilm formation abilities. COPD: chronic obstructive pulmonary disease; VAP: ventilator associated pneumonia

表2 兩組綠膿菌素含量比較

COPD: chronic obstructive pulmonary disease; VAP: ventilator associated pneumonia

表3兩組彈性蛋白酶含量比較

Table 3 Production of elastase between two groups [n(%)]

Group nA495nm<0．1A495nm0．1-0．6A495nm>0．6COPD2218(81．8)2(9．1)2(9．1)VAP2622(84．6)2(7．7)2(7．7)

COPD: chronic obstructive pulmonary disease; VAP: ventilator associated pneumonia

綠膿菌素和彈性蛋白酶是銅綠假單胞菌重要的毒力因子[13,14]。CD-1小鼠的急性肺炎模型研究顯示：小鼠不能清除野生型銅綠假單胞菌；但是小鼠可以清除綠膿菌素缺乏突變的銅綠假單胞菌的感染，與野生型銅綠假單胞菌相比，細(xì)菌負(fù)荷可以下降1000～10 000倍[15]。彈性蛋白酶可以破壞機(jī)體組織的完整性，影響宿主的免疫系統(tǒng)。缺乏彈性蛋白酶的突變株與原菌株相比，更容易被清除。我們的研究顯示：銅綠假單胞菌重要的毒力因子綠膿菌素和彈性蛋白酶的含量在COPD組與VAP組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但存在個(gè)體差異。

綜上所述，銅綠假單胞菌感染后，其在COPD 和VAP中的生物被膜形成能力及產(chǎn)生的主要毒力因子能力相似。但此結(jié)論尚需要大樣本的研究去證實(shí)。

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