權(quán)國波，吳國權(quán)，呂春榮，梁家充，陳必春，邵慶勇，洪瓊花*

（1． 云南省畜禽遺傳資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新工程實驗室，云南省肉羊工程技術(shù)研究中心，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224；2．魯?shù)榭h畜牧獸醫(yī)局，云南昭通 657100）

抗凍蛋白對山羊精子冷凍保護(hù)效果的分析

權(quán)國波1，吳國權(quán)1，呂春榮1，梁家充1，陳必春2，邵慶勇1，洪瓊花1*

（1． 云南省畜禽遺傳資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新工程實驗室，云南省肉羊工程技術(shù)研究中心，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224；2．魯?shù)榭h畜牧獸醫(yī)局，云南昭通 657100）

本實驗系統(tǒng)評價了抗凍蛋白Ⅲ（AFPⅢ）對山羊精子的冷凍保護(hù)效果。采用假陰道法采集6只云南黑山羊精液，離心洗滌去除精漿后和冷凍稀釋液（0、0．1、1、10、100 μg/mL AFPⅢ）混合，經(jīng)4℃平衡、液氮氣相預(yù)凍后直接投入液氮保存。解凍后檢測精子活力、頂體、質(zhì)膜以及早期凋亡等指標(biāo)。同時采用透射電鏡（TEM）觀察冷凍對精子超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：與對照組相比，AFPⅢ并不能顯著改善山羊解凍后精子活力、頂體完整性、質(zhì)膜完整性和低滲耐受性（P＞0．05）。此外，AFPⅢ并不能抑制解凍后精子的磷脂酰絲氨酸（PS）外翻。電鏡實驗結(jié)果進(jìn)一步證實，AFPⅢ并不能有效保護(hù)冷凍精子質(zhì)膜?？傊?，本實驗證實，AFPⅢ并不能降低山羊精子的冷凍損傷，相反其可能加重冷凍對精子質(zhì)膜的損傷，其損傷機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

山羊精子；冷凍；抗凍蛋白；質(zhì)膜

目前，國內(nèi)外對山羊精子的冷凍保存研究報道要明顯少于牛、豬和綿羊。我國山羊精液冷凍保存研究始于20世紀(jì)80年代，截至目前，在大多數(shù)的試驗中，山羊凍精解凍后的活率不能穩(wěn)定地超過50%[1]。山羊精液在冷凍過程中要面臨諸多挑戰(zhàn)，主要包括溫度變化沖擊、滲透損傷、化學(xué)毒性損傷、氧化損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)外冰晶的機(jī)械損傷等[2]。另外，山羊精液中含有一種特殊的磷脂酶A。該酶可以將蛋黃中的卵磷脂水解為脂肪酸和溶血卵磷脂，從而導(dǎo)致質(zhì)膜通透性增加，誘發(fā)頂體反應(yīng)和染色體解聚，最終導(dǎo)致精子的死亡[3-4]。自然界中，為了降低冷凍對組織細(xì)胞的損傷，一些極地魚類可以通過合成AFP來抑制冰晶形成。抗凍蛋白（AFP）并不能防止冰晶的形成，但是它們可以修飾冰晶的大小、性狀和團(tuán)聚等[5-7]。在哺乳動物精子方面，已經(jīng)有研究將AFP應(yīng)用于綿羊、家兔、牛、水牛、豬、小鼠和靈長類精液的冷凍保存[8-14]，而且大部分研究均對AFP的冷凍保護(hù)效果持肯定態(tài)度[8-9,11-14]。

目前，尚未見將AFP應(yīng)用于山羊精子冷凍保存的研究報道，而且對于AFP對精子的冷凍保護(hù)效果尚存在爭議。本實驗系統(tǒng)分析了AFPⅢ對云南黑山羊精液的冷凍保護(hù)效果，旨在建立一套適合山羊精液冷凍保存的技術(shù)體系。

1 材料與方法

1． 1 試劑和稀釋液 如無特殊說明，本實驗所用的化學(xué)試劑均購自Sigma公司。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司。AFPⅢ購自A/F PROTEIN, Inc。

本實驗所使用的精液基礎(chǔ)稀釋液（TCG）主要成分包括：375．0 mmol/L Tris、124．0 mmol/L 檸檬酸和41．0 mmol/L葡萄糖。冷凍稀釋液由375 mmol/LTris、124 mmol/L檸檬酸、41．0 mmol/L 葡萄糖、20%新鮮蛋黃、0．05% SDS、5%甘油、10萬IU青霉素、10萬IU鏈霉素和AFPⅢ（0、0．1、1、10、100 μg/mL）組成。所有的精子稀釋液用Tris調(diào)整pH至7． 0。最后將所有的精子冷凍稀釋液于10 000×g下離心40 min，取上清用0．45 μm的一次性濾器過濾備用。

1．2 方法

1．2．1 精液采集和處理 采用假陰道法采集6只健康、成年（2～4歲）云南黑山羊公羊精液。采集后15 min內(nèi)運至實驗室進(jìn)行質(zhì)量評價。用于冷凍保存的精液質(zhì)量應(yīng)該滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：精液量1～2 mL，最低精子密度1．5×109個/mL，精子活力在70%以上。將符合標(biāo)準(zhǔn)的精液用TCG 5倍稀釋后于700×g 離心10 min去除精漿，然后用TCG反復(fù)洗滌山羊精子2次。最后在精子沉淀中加TCG至原精體積。根據(jù)所采用的冷凍稀釋液將精液分為5等份，分別按照1:5的比例加入冷凍稀釋液，并混合均勻。

1．2．2 冷凍和解凍 將稀釋后的精液分裝于0．25 mL塑料細(xì)管（IMV，F(xiàn)rance），然后以0．01℃/min 的速度緩慢降溫至4℃，并于該溫度下進(jìn)一步平衡3 h。然后將冷凍細(xì)管置于自制的鋁板上，在液氮蒸氣中熏蒸10 min，預(yù)凍速度約為90℃/min。降溫和冷凍速度采用德圖測溫儀（Testo 925，TESTO，Germany）測定。預(yù)凍后直接將冷凍細(xì)管投入液氮中保存1個月。解凍時，將冷凍細(xì)管投入37℃水浴中30 s。

1．2．3 各項指標(biāo)的檢測

1．2．3．1 精子活力 采用邁朗精子分析儀檢測精子活力，具體操作參見儀器操作說明。

1．2．3．2 精子的頂體完整性 采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的豌豆凝集素（FITC－PSA）進(jìn)行檢測。操作步驟如下：取10 μL解凍后的精液加入500 μL PBS中，而后加入FITC－PSA混勻后于37℃水浴孵育30 min，最后上流式進(jìn)行分析，根據(jù)熒光強(qiáng)度的大小判斷精子的頂體完整性。

1．2．3．3 精子早期凋亡和質(zhì)膜完整性 用凱基的細(xì)胞凋亡試劑盒檢測，具體操作步驟參見使用說明。

1．2．3．4 精子低滲耐受性實驗（HOST） 取10 μL解凍精液加入100 μL低滲緩沖液（5 mmol/L果糖、2．55 mmol/L檸檬酸鈉），混勻后于37℃水浴中孵育30 min，然后涂片在倒置顯微鏡下觀察發(fā)生彎尾的精子數(shù)，共統(tǒng)計400個精子。

1．2．3．5 TEM實驗 解凍后山羊精子于4℃下600×g離心10 min去除上清，而后加PBS與相同條件下反復(fù)洗滌2次。在精子沉淀中緩慢加入3．5%戊二醛溶液，4℃平衡48 h。之后細(xì)胞用0．1 mol/L二甲基胂酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌3次。細(xì)胞沉淀用1%四氧化鋨固定1 h，再用0．1 mol/L二甲基胂酸鹽緩沖液洗滌15 min。四氧化鋨固定后的細(xì)胞經(jīng)乙醇和丙酮梯度脫水并用Epon-618浸潤24 h。采用萊卡超薄切片機(jī)制作切片，切片厚度約為60～70 nm。切片經(jīng)4%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛避光處理10 min后采用Jeol JEM-1011電子顯微鏡（Jeol Ltd．, Akishima, Japan）進(jìn)行精子超微結(jié)構(gòu)觀察。

1． 3 統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析（LSD）。實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0． 05 或P＜0． 01 表示組間差異顯著或極顯著。

2 結(jié) 果

2．1 AFPⅢ對山羊冷凍精子各項指標(biāo)的影響 如圖1所示，解凍后未添加AFPⅢ處理組精子活力為（42．93±8．95）%。隨著AFPⅢ濃度的增加，解凍后精子活力呈逐步下降的趨勢。當(dāng)AFPⅢ濃度為1 μg/mL時，精子活力為（35．62±7．46）%，顯著低于不加AFPⅢ處理組（P＜0．05）。當(dāng)AFPⅢ濃度進(jìn)一步增加至100 μg/mL時，其活力僅為（30．29±7．02）%，與不加AFPⅢ處理組間差異極顯著（P＜0．01）。

圖1 AFPⅢ對山羊冷凍精子活力的影響

此外，AFPⅢ并不能顯著改善解凍后山羊精子的頂體完整性。最右側(cè)亞群代表頂體完整性最好的精子群，而其他2個亞群代表頂體部分完整的精子細(xì)胞群。隨著AFPⅢ濃度的增加，冷凍精子的頂體完整基本維持在58%左右，而且各處理組之間差異不顯著（P＞0．05）。

AFPⅢ對冷凍精子質(zhì)膜和磷脂酰絲氨酸（PS）分布的影響見圖3。流式分析散點圖顯示，解凍后精子經(jīng)Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）雙標(biāo)后分為4個細(xì)胞亞群。左下角細(xì)胞群代表正常精子（Annexin V和PI均陰性）；右下角細(xì)胞群代表早期凋亡細(xì)胞群（Annexin V陽性，PI陰性）；左上角細(xì)胞群代表壞死細(xì)胞（Annexin V陰性，PI陽性）；右上角細(xì)胞群代表晚期凋亡細(xì)胞（Annexin V和PI陽性）。圖3A表明，隨著AFPⅢ濃度的升高，精子的質(zhì)膜完整性呈逐步下降的趨勢。當(dāng)冷凍稀釋液中不含AFPⅢ時，其質(zhì)膜完整率為（49．51±6．53）%。當(dāng)AFPⅢ濃度提高至0．1 μg/mL時，其質(zhì)膜完整率驟降至（38．42±8．49）%，顯著低于不加AFPⅢ處理組（P＜0．05）。當(dāng)AFPⅢ濃度為10 μg/mL時，解凍后精子質(zhì)膜完整率僅為20%左右，與不加AFPⅢ組差異極顯著（P＜0．01）。此外，AFPⅢ并不能防止冷凍導(dǎo)致的精子質(zhì)膜PS外翻。如圖3B所示，當(dāng)AFPⅢ濃度為0．1 μg/mL時，精子PS標(biāo)記率顯著高于不添加AFPⅢ冷凍組（53．19% vs 42．71%，P＜0．05）。當(dāng)AFPⅢ濃度進(jìn)一步提高至10 μg/mL時，其PS標(biāo)記率在60%以上，與不加AFPIII冷凍組差異極顯著（P＜0．01）。

AFPⅢ對山羊冷凍精子低滲耐受性的影響見圖4。隨著抗凍蛋白濃度的升高，解凍后精子低滲耐受性呈逐步下降的趨勢。當(dāng)AFPⅢ濃度為1 μg/mL時，精子彎尾率為（30．38±7．45）%，顯著低于不加AFPⅢ冷凍組精子（P＜0．05）。當(dāng)AFPⅢ濃度進(jìn)一步提高至10 μg/mL時，解凍后精子彎尾率僅為25%左右，極顯著低于不加AFPⅢ冷凍組（P＜0．01）。2．2 AFPⅢ對山羊冷凍精子超微結(jié)構(gòu)的影響 本實驗結(jié)果表明，冷凍解凍過程嚴(yán)重?fù)p傷精子超微結(jié)構(gòu)。AFPⅢ對山羊冷凍精子超微結(jié)構(gòu)的影響見圖5。當(dāng)冷凍稀釋液中AFPⅢ濃度為1 μg/mL時，解凍后，一些精子的質(zhì)膜發(fā)生腫脹、斷裂甚至從頭部脫落（圖5A、5C和5D）。此外，冷凍解凍過程導(dǎo)致精子頂體外膜斷裂甚至脫落（圖5A），而且在一些解凍后的精子中頂體內(nèi)容物發(fā)生部分甚至全部泄漏（圖5B和5C），這可能是導(dǎo)致精子受精能力下降的一個原因。TEM結(jié)果進(jìn)一步證實，AFPⅢ并不能降低冷凍過程對精子質(zhì)膜和頂體的損傷（圖5C和5D）。當(dāng)冷凍稀釋液中沒有AFPⅢ時，其質(zhì)膜和精子頭部發(fā)生分離，而且部分精子頂體內(nèi)容物發(fā)生泄漏（圖5C）。然而添加AFP并不能有效提高精子質(zhì)膜和頂體的質(zhì)量。

圖2 AFP對山羊冷凍精子頂體完整性的影響

圖3 AFPⅢ對山羊冷凍精子質(zhì)膜完整性和PS分布的影響

圖4 AFPⅢ對山羊冷凍精子低滲耐受性的影響

3 討 論

圖5 AFPⅢ對山羊冷凍精子超微結(jié)構(gòu)的影響

冰晶形成嚴(yán)重影響哺乳動物冷凍精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性。自從DeVrie等[15]發(fā)現(xiàn)一些極地魚類可以通過合成AFP提高其冷凍耐受性以來，研究人員已經(jīng)嘗試將AFP應(yīng)用于動物精子的冷凍保存[8-14]。但是對于抗凍蛋白的作用機(jī)制尚不明確，推測其冷凍保護(hù)作用可能是通過改變冰晶形狀、防止重結(jié)晶或與質(zhì)膜的相互作用來實現(xiàn)的。目前，尚未建立一套安全有效、標(biāo)準(zhǔn)化的山羊凍精制作程序，而且關(guān)于山羊精液冷凍保存的研究報道要明顯少于其他家畜。本實驗首次嘗試通過分析AFP對山羊精液的冷凍保存效果來進(jìn)一步優(yōu)化當(dāng)前的山羊凍精制作程序。

本實驗結(jié)果表明，在冷凍稀釋液中添加AFPⅢ并不能降低冷凍對山羊精子活力和頂體的損傷；而且隨著抗凍蛋白濃度的增加，解凍后精子的活力呈逐步加重的趨勢。然而國外的一些研究表明，AFP可以對哺乳動物精子提供一定的冷凍保護(hù)作用。例如，AFPⅢ可以提高靈長類動物精子解凍后的活力[11]。此外，AFP能夠提高綿羊冷凍精子的頂體完整性[8]。造成實驗結(jié)果差異的原因可能是由于動物種類不同或采用的AFP產(chǎn)品不同。然而，爭議性的結(jié)果仍然存在。在小鼠上，Koshimoto等[10]得出了與本研究類似的結(jié)論。開始他們認(rèn)為AFP可以抑制重結(jié)晶從而緩解精子細(xì)胞的冷凍損傷。然而，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度（1～100 μg/mL）的AFPI、AFPⅢ或抗凍糖蛋白并不能有效地保護(hù)小鼠冷凍精子；相反，隨著AFP濃度的升高，解凍后小鼠精子的存活率呈逐步下降的趨勢。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)AFPⅢ無法降低冷凍解凍過程對山羊精子質(zhì)膜的損傷。TEM實驗結(jié)果也證實了這個結(jié)論。解凍后精子質(zhì)膜完整率隨著AFPⅢ濃度的升高呈逐步下降的趨勢。此外，AFPⅢ也不能抑制冷凍解凍過程導(dǎo)致的質(zhì)膜PS外翻。眾所周知，PS外翻是細(xì)胞早期凋亡的一個重要標(biāo)志，這表明AFPⅢ不能防止冷凍精子的早期凋亡。隨著AFPⅢ濃度的升高，解凍后精子的PS標(biāo)記率呈逐步增加的趨勢，當(dāng)AFPⅢ濃度提高至1%時，其PS標(biāo)記率在60%以上，而且大部分是晚期凋亡細(xì)胞，這從另一個側(cè)面反映了冷凍嚴(yán)重破壞了精子質(zhì)膜的完整性。HOST實驗結(jié)果表明，AFPⅢ并不能提高山羊冷凍精子的低滲耐受性。根據(jù)目前的報道，精子的低滲耐受性和其受精能力直接相關(guān)。而國外報道認(rèn)為AFPI（0．1～10 μg/mL）可以提高牛精子的滲透壓耐受性，而且這種現(xiàn)象與冰晶間細(xì)胞排列方向有關(guān)[9]。我們無法確定結(jié)果差異是否是由于采用的抗凍蛋白種類不同所引起的。

4 結(jié) 論

本實驗表明，在精液冷凍稀釋液中添加AFPⅢ并不能改善山羊冷凍精子的質(zhì)量，其原因尚需要進(jìn)一步的研究。造成目前AFP冷凍保存效果差異的原因可能與特定的實驗條件有關(guān)，例如動物種類、AFP種類以及冷凍程序等。此外，盡管AFP可以改變冰晶形狀，但是其可能誘導(dǎo)冰晶變成尖銳的針狀冰晶，從而加重冷凍對細(xì)胞的損傷程度。另外，本實驗進(jìn)一步證實冷凍主要損傷部位在于精子質(zhì)膜，如何有效地保護(hù)精子質(zhì)膜完整性仍然需要深入的研究。

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Analysis of the Protective Ef f ects of Antifreeze Proteins on Frozen Goat Sperm

QUAN Guo-bo1, WU Guo-quan1, LV Chun-rong1, LⅠANG Jia-chong1, CHEN Bi-chun2, SHAO Qing-yong1, HONG Qiong-hua1*
(1. Yunnan Provincial Engineering Laboratory of Animal Genetic Resource Conservation and Germplasm Enhancement, Kunming City, Yunnan Provincial Meat Caprine Engineering Research Center, Kunming City, Yunnan Animal Science and Vetrinary Ⅰnstitute, Kunming City, Yunnan Kunming 650224, China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Ludian County, Zhaotong city, Yunnan Zhaotong 657100, China)

The protective effects of antifreeze protein Ⅲ(AFPⅢ) on frozen goat sperm were evaluated in the present study. Semen was collected from six Yunnan Black goats using an artificial vagina. After removing seminal plasma by centrifugation, the cell pellets were equally mixed with the freezing extenders containing 0, 0.1 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/ mL, or 100 μg/mL AFP. The sperm were prefrozen in liquid nitrogen vapor after equilibration at 4℃. Finally, the sperm were plunged into liquid nitrogen. After thawing, the sperm motility, acrosome, plasma membrane and cell apoptosis were determined. At the same time, the transmission electron microscope (TEM) was used to observe the ultrastructural alterations of frozen-thawed sperm. The results indicated that the presence of AFPⅢ could not signif i cantly improve the post-thaw motily, acrosome integrity, membrane integrity, and tolerance to hypotonicity in goat sperm as compared to the control group (P＞0.05). Ⅰn addition, AFPⅢ could not prevent the exposure of phosphatidylserine (PS). The TEM results further proved that AFPⅢ could not efficiently protect the plasma membrane of frozen-thawed sperm. This study indicated that AFPⅢ could not reduce the cryoinjuries on goat sperm. On the contrary, the addition of AFPⅢ to the freezing extenders may aggravate the injury on the plasma membrane of goat sperm. The detailed damaging mechanism still needs further research.

Goat sperm; Freezing; Antifreeze protein; Plasma membrane

S827.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-053

2016-08-31；

2016-09-30

國家自然科學(xué)基金（31360551、31560635）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目（2016FB042）；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計劃（2014HB051）；云南省科技計劃項目（2014BB014）；云南省高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展項目計劃（201404）；家養(yǎng)動物種質(zhì)資源平臺

權(quán)國波（1975-），男，山東煙臺人，副研究員，博士，研究方向為家畜胚胎生物技術(shù)和低溫生物學(xué)，E-mail: waltq20020109@163．com

*通訊作者：洪瓊花（1968-），女，研究員，云南大理人，主要從事家畜遺傳育種與繁殖研究，E-mail: yxh7168@126．com