高金愛，崔巍

(中國科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院， 北京 101408)

在藥物研發(fā)過程中，許多潛在的藥物由于跨膜性質(zhì)不佳而被淘汰，因此，藥物跨膜能力是藥物開發(fā)過程中必須考慮的重要因素[1-3]。細(xì)胞穿膜肽是一類序列長度小于30個(gè)氨基酸的短肽，可以穿過細(xì)胞膜而不對(duì)細(xì)胞造成損害，因此可以作為載體將藥物、核酸和蛋白質(zhì)等生物活性分子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中[4-9]，從而使活性分子更好地發(fā)揮作用。近年來，細(xì)胞穿膜肽作為潛在的藥物遞送載體已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注，探究細(xì)胞穿膜肽的作用機(jī)理對(duì)細(xì)胞穿膜肽的臨床應(yīng)用研究具有重要意義。

S4(13)是從螺旋抗菌肽Dermaseptin S4中截取出來的一段細(xì)胞穿膜肽(圖S1)，它由13個(gè)氨基酸殘基(ALWKTLLKKVLKA)構(gòu)成，其中的Lys氨基酸殘基使S4(13)整體帶正電。研究表明S4(13)經(jīng)過核定位信號(hào)肽修飾之后，可以參與腫瘤細(xì)胞中siRNA的遞送過程和實(shí)現(xiàn)基因沉默，同時(shí)具有對(duì)細(xì)胞毒性低的優(yōu)點(diǎn)[9-14]。已有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明S4(13)能夠進(jìn)入細(xì)胞[13]，它的穿膜特點(diǎn)決定了它的衍生物具有遞送核酸的作用，但是，關(guān)于S4(13)穿膜的具體機(jī)理尚不清楚[15]。目前的研究中只有S4(13)修飾后的產(chǎn)物S4(13)-PV穿膜的相關(guān)報(bào)道，即Mano等通過抑制內(nèi)吞途徑的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)S4(13)-PV進(jìn)入細(xì)胞的過程并沒有受到影響，證明了S4(13)-PV的穿膜過程普遍是非內(nèi)吞的作用機(jī)制[16]，并且他們用實(shí)驗(yàn)說明了S4(13)-PV是以直接易位的方式進(jìn)入細(xì)胞膜，細(xì)胞膜的組分會(huì)對(duì)穿膜過程產(chǎn)生影響[16-17]。Padari等[18]通過圓二色譜法發(fā)現(xiàn)S4(13)-PV會(huì)組裝成特定大小和形狀的聚集體。雖然現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)支持S4(13)直接易位的作用機(jī)制，但是目前還不清楚S4(13)是以單分子形式還是以聚集體的形式穿膜。

本文使用分子動(dòng)力學(xué)模擬[19-20]的方法研究細(xì)胞穿膜肽S4(13)與質(zhì)膜的相互作用，用1-棕櫚?；?2-油?；字Ｄ憠A(POPC)和1-棕櫚?；?2-油酰基磷脂酰甘油(POPG)2種磷脂分子搭建的雙分子層分別代表真核生物質(zhì)膜和原核生物質(zhì)膜，對(duì)單個(gè)和多個(gè)S4(13)分子在單純水相和水膜兩相的環(huán)境下分別進(jìn)行常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過傘形采樣模擬單個(gè)多肽分子在膜上的吸附和擴(kuò)散以及多個(gè)多肽分子在水溶液中的聚集過程，并尋找多肽和質(zhì)膜作用過程中涉及的關(guān)鍵殘基，以此為穿膜肽跨生物膜運(yùn)輸活性分子的研究提供理論參考，幫助設(shè)計(jì)更理想的細(xì)胞穿膜肽。

1 研究方法

1.1 構(gòu)建分子動(dòng)力學(xué)模擬體系

本項(xiàng)工作用到的細(xì)胞穿膜肽S4(13)的結(jié)構(gòu)(圖S1)來自于穿膜肽數(shù)據(jù)庫CPPsite2.0[21-23]，該結(jié)構(gòu)具有兩親性，疏水性氨基酸和親水性氨基酸分別分布在螺旋兩側(cè)；分別以POPC和POPG構(gòu)造質(zhì)膜模型，以模擬真核和原核生物細(xì)胞膜[24]。磷脂分子POPC和POPG的結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫[25]中獲取。使用Gaussian 09[26]選擇HF/6-31 G*方法和基組建立磷脂分子的GAFF力場[27]參數(shù)，步驟包括：首先對(duì)磷脂分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，然后利用Amber 18[28]中的antechamber程序計(jì)算每個(gè)原子的RESP靜電荷[29-30]，最后利用parmchk2程序補(bǔ)充相關(guān)的力場參數(shù)。完成磷脂分子力場參數(shù)的構(gòu)建之后，用Packmol[31]和Amber 18軟件的tleap程序分別搭建如表1所示8個(gè)體系的起始結(jié)構(gòu)，根據(jù)Packmol盒子的大小和磷脂分子以及水分子的密度確定每個(gè)體系中磷脂分子和水分子的個(gè)數(shù)。分別用S1～S8表示本文中8個(gè)常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬的體系(S1～S3體系用于分析單個(gè)多肽的性質(zhì)，S4～S8用于分析多個(gè)多肽的性質(zhì))。S4～S6體系中，5個(gè)多肽分子在空間上分布較遠(yuǎn)，S7體系中5個(gè)多肽分子分布較緊密，S8體系中4個(gè)多肽分子來自于S7體系平衡后的聚集體結(jié)構(gòu)。

表1 常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬的體系Table 1 System list of classical MD simulations

1.2 常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬

所有的動(dòng)力學(xué)模擬和分析均使用Amber 18軟件包進(jìn)行。S4(13)采用Amber ff14SB力場[32]，磷脂分子采用GAFF力場，所有的水分子都采用TIP3P水[33]。用tleap程序?yàn)槠涮砑涌购怆x子以及周期邊界盒子，生成動(dòng)力學(xué)模擬所需要的拓?fù)湮募妥鴺?biāo)文件，最終進(jìn)行相應(yīng)時(shí)長的分子動(dòng)力學(xué)模擬。每個(gè)體系進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬之前，首先經(jīng)歷3步優(yōu)化的過程除去體系中的不合理原子接觸和碰撞，釋放初始結(jié)構(gòu)中不合理因素帶來的張力，達(dá)到勢(shì)能面較平穩(wěn)的狀態(tài)：1) 約束多肽，有質(zhì)膜的體系同時(shí)約束磷脂分子，優(yōu)化除此之外的水分子和抗衡離子；2) 約束多肽的骨架原子，有質(zhì)膜的體系對(duì)磷脂分子的頭尾原子進(jìn)行約束，對(duì)多肽側(cè)鏈以及其他組分進(jìn)行優(yōu)化；3) 不加任何約束進(jìn)行優(yōu)化。這3步優(yōu)化都是先采用最陡下降法，后采用共軛梯度的方法進(jìn)行優(yōu)化。之后，每個(gè)體系在NPT系綜條件(壓力設(shè)置為100 kPa)下經(jīng)歷7步升溫過程，將體系從0 K均勻地加熱到310 K，無質(zhì)膜的體系經(jīng)歷500 ps的升溫過程，有質(zhì)膜的體系經(jīng)歷1 ns，直至體系密度達(dá)到平穩(wěn)。對(duì)每個(gè)平穩(wěn)后的體系在NVT系綜條件下進(jìn)行如表1所示相應(yīng)時(shí)長的分子動(dòng)力學(xué)模擬，模擬步長設(shè)置為2 fs，軌跡每隔1 ps寫入一次，用Berendsen thermostat恒溫?zé)嵩》椒刂茰囟染S持穩(wěn)定在310 K附近，用SHAKE算法[34]約束含氫共價(jià)鍵的伸縮振動(dòng)，將長程相互作用的截?cái)嘀翟O(shè)置為1.0 nm，使用particle mesh Ewald (PME)方法[35]處理分子模擬中的長程靜電相互作用。

1.3 傘形采樣分子動(dòng)力學(xué)模擬

為說明單個(gè)S4(13)分子在不同質(zhì)膜上的吸附和擴(kuò)散行為，應(yīng)用傘形采樣方法將S4(13)分子分別從POPC和POPG質(zhì)膜中心沿著垂直于質(zhì)膜平面的z軸方向拉到距離質(zhì)膜中心6 nm的位置處，定義質(zhì)膜中心和多肽分子質(zhì)心的距離作為反應(yīng)坐標(biāo)。設(shè)置傘形采樣窗口數(shù)為61，每個(gè)采樣窗口的寬度設(shè)為0.1 nm，施加外力的力常數(shù)大小設(shè)置為1 046 kJ/(mol·nm2)，每個(gè)采樣窗口模擬的時(shí)間為10 ns。對(duì)每個(gè)采樣窗口，分子動(dòng)力學(xué)模擬的步長都設(shè)置為2 fs，每隔2 ps寫入一次軌跡，在310 K溫度條件下進(jìn)行模擬。另外，為說明多個(gè)S4(13)分子在水相中發(fā)生聚集的趨勢(shì)，對(duì)S8體系中聚集體的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，施加外力將其中一個(gè)S4(13)分子從其他3個(gè)S4(13)分子的質(zhì)心位置沿著遠(yuǎn)離聚集體的方向拉到距離質(zhì)心3 nm的位置，定義被拉的S4(13)分子的質(zhì)心和另外3個(gè)S4(13)分子的質(zhì)心的距離作為反應(yīng)坐標(biāo)，設(shè)置傘形采樣的窗口數(shù)為26，其他模擬條件與S4(13)在質(zhì)膜上所進(jìn)行的傘形采樣模擬條件一致。最后，使用加權(quán)柱狀圖分析方法通過Wham程序[36-37]計(jì)算這3組傘形采樣動(dòng)力學(xué)模擬過程中的自由能，繪制平均力勢(shì)(potential of mean force, PMF)曲線。

1.4 分子動(dòng)力學(xué)軌跡分析

各個(gè)體系的動(dòng)力學(xué)軌跡分析都由Amber 18軟件包中的cpptraj程序[38]完成。包括多肽骨架原子均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)的計(jì)算、氫鍵的統(tǒng)計(jì)(采用cpptraj默認(rèn)的氫鍵標(biāo)準(zhǔn))、二級(jí)結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)、回轉(zhuǎn)半徑(radius of gyration，Radgyr)的計(jì)算、質(zhì)量密度的計(jì)算、相關(guān)系數(shù)的計(jì)算、接觸強(qiáng)度的計(jì)算以及特定幀結(jié)構(gòu)的提取。

2 結(jié)果與討論

2.1 軌跡分析判斷體系的穩(wěn)定性

各個(gè)體系升溫過程中的密度變化(圖S2)反映了密度在升溫過程中都已達(dá)到平衡。S4(13)骨架原子均方根偏差(RMSD)的計(jì)算結(jié)果(圖S3)表明每個(gè)體系在動(dòng)力學(xué)軌跡最后150 ns都已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定和平衡。為使每個(gè)體系有足夠的采樣，每個(gè)體系進(jìn)行一定長時(shí)間的分子動(dòng)力學(xué)模擬后，均選用最后150 ns軌跡進(jìn)行各種性質(zhì)的統(tǒng)計(jì)與分析。RMSD數(shù)據(jù)還提示含有單個(gè)S4(13)分子的體系S1～S3的RMSD較小，含有多個(gè)S4(13)分子的體系S4～S7的RMSD較大且相互存在差異：S5和S7體系的RMSD值穩(wěn)定在1 nm左右，說明S4(13)可能維持結(jié)合狀態(tài)，受到比較穩(wěn)定的相互作用；而S4和S6體系的RMSD穩(wěn)定在4 nm左右，可能是因?yàn)轶w系中有靈活性比較大的多肽分子。

2.2 單個(gè)S4(13)分子與不同質(zhì)膜相互作用對(duì)比

統(tǒng)計(jì)最后150 ns動(dòng)力學(xué)軌跡中，S2和S3體系中磷脂親水端、磷脂疏水端、磷原子、水分子和S4(13)分子在垂直于質(zhì)膜雙層平面法線方向的質(zhì)量密度分布和不同殘基的Cα原子與磷原子平面的距離(圖1)，用來描述多肽整體和各個(gè)殘基在多肽結(jié)合到質(zhì)膜表面時(shí)相對(duì)于質(zhì)膜的位置。密度分布圖(圖1(a)、1(b))中，為方便觀察，將質(zhì)膜的重心位置定義為Zposition=0，考慮到S4(13)的密度遠(yuǎn)小于其他組分，其密度使用右側(cè)坐標(biāo)軸，比例尺為其他組分密度的1/5。S4(13)的密度分布越靠近質(zhì)膜，說明肽與質(zhì)膜的作用越強(qiáng)；殘基的Cα原子和磷原子平面的距離越小，提示該殘基越靠近質(zhì)膜，說明這個(gè)殘基參與肽與質(zhì)膜相互作用的可能性更大。結(jié)果表明S4(13)和POPG膜有更強(qiáng)的相互作用，這歸因于POPG膜體系的磷脂分子帶負(fù)電，可以和帶正電的S4(13)分子形成較強(qiáng)的靜電相互作用。

圖1 沿z軸方向體系S2、S3各組分的密度分布圖和各個(gè)殘基的Cα原子距離磷原子平面的距離圖Fig.1 The mass density distribution map of the components and the distance between Cα atoms of each residue and average plane of phosphorus atoms along z direction in systems S2 and S3

通常2層磷脂親水頭部間的距離可以用于描述質(zhì)膜的厚度，密度分布圖表明S4(13)分子對(duì)POPG膜和POPC膜厚度的影響可以忽略不計(jì)。隨著模擬的進(jìn)行，2個(gè)體系S4(13)分子的質(zhì)量密度(圖(1(a)、1(b))，橙色區(qū)域)都集中分布在水相和質(zhì)膜親水端區(qū)域內(nèi)，說明S4(13)分子與2種質(zhì)膜都有作用。但是，S2體系的S4(13)分子在垂直于POPC膜平面方向上密度分布更廣，S3體系的S4(13)分子在垂直于POPG膜平面方向上密度分布更集中，說明S4(13)分子在POPC膜體系中有較大的運(yùn)動(dòng)自由度，在POPG膜中運(yùn)動(dòng)受到限制。

圖1(c)表明S4(13)在POPC膜中只有多肽鏈N-端的3個(gè)氨基酸殘基Ala-1、Leu-2和Trp-3靠近了磷原子平面，與質(zhì)膜的親水端形成相互作用；圖1(d)表明在POPG膜體系中，S4(13)的兩端和質(zhì)膜都有作用，其中Ala-1、Lys-12和Ala-13是距離磷原子平面最近的3個(gè)殘基；S4(13)中間部分的Lys-4和Lys-9殘基也和質(zhì)膜有作用。綜上，與POPC膜有作用的主要是疏水性氨基酸殘基，與POPG膜有作用的主要是多肽鏈頭尾部分的氨基酸殘基加上中間部分的帶電殘基，這說明靜電相互作用對(duì)于多肽和細(xì)菌質(zhì)膜的作用有重要意義。

為研究S4(13)穿過質(zhì)膜在膜中的擴(kuò)散過程，利用增強(qiáng)采樣的方法對(duì)這一過程進(jìn)行模擬。因此，采用傘形采樣的方法模擬S4(13)分子從質(zhì)膜中心擴(kuò)散到水相中的過程，從而對(duì)比S4(13)在2種質(zhì)膜上吸附和擴(kuò)散的難易程度。

對(duì)傘形采樣的數(shù)據(jù)應(yīng)用加權(quán)直方圖分析方法計(jì)算平均力勢(shì)(圖2)，PMF曲線表示S4(13)的自由能沿著質(zhì)膜中心到水相距離變化(定義質(zhì)膜中心的位置為0)。圖中結(jié)果表明單分子S4(13)吸附到POPG膜表面上比吸附到POPC膜表面上更容易,其自由能呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明S4(13)吸附到POPG膜表面是自發(fā)的過程。在POPC膜體系中，多肽吸附到膜上首先自由能需升高5.19 kJ/mol。而對(duì)于多肽從膜中心向水相擴(kuò)散的過程：在POPC體系中，多肽質(zhì)心在z軸方向0.425 nm位置處和膜的結(jié)合最穩(wěn)定，在POPG體系中，在z軸方向0.192 nm位置處和膜的結(jié)合最穩(wěn)定。在POPC膜體系中從質(zhì)膜中心擴(kuò)散到水相的勢(shì)壘為181.45 kJ/mol；而對(duì)于POPG膜體系，多肽從質(zhì)膜中心擴(kuò)散到水相的勢(shì)壘為136.28 kJ/mol，該結(jié)果表明多肽S4(13)不容易以單分子的形式穿過細(xì)胞膜。

圖2 POPC和POPG 膜體系中S4(13)從質(zhì)膜中心沿z軸方向向水層擴(kuò)散的平均力勢(shì)曲線Fig.2 PMF profiles for the peptide S4(13) to move from membrane center to aqueous solution along z direction in POPC and POPG systems

2.3 多個(gè)S4(13)分子與不同質(zhì)膜相互作用對(duì)比

回轉(zhuǎn)半徑可以表征體系聚集的程度，如圖3所示，黑線是回轉(zhuǎn)半徑隨時(shí)間的變化，用紅線擬合變化趨勢(shì)。在S4、S6和S7體系中，根據(jù)回轉(zhuǎn)半徑曲線的趨勢(shì)可以看出聚集現(xiàn)象的發(fā)生。而對(duì)于S5體系，不容易發(fā)生聚集現(xiàn)象。這表明在POPC膜和水溶液中，S4(13)容易發(fā)生聚集，在POPG膜上由于和質(zhì)膜形成強(qiáng)的相互作用，S4(13)的運(yùn)動(dòng)受到限制不容易發(fā)生聚集。

圖4中4個(gè)體系的初始結(jié)構(gòu)和模擬后的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)對(duì)比單個(gè)S4(13)與多個(gè)S4(13)分子與不同質(zhì)膜的作用，每個(gè)體系的S4(13)都用紅色的cartoon模型表示，磷原子顯示為橙色小球模型，水分子和磷脂分子都顯示為線狀模型。為便于觀察，隱藏抗衡離子。S2和S3體系采用側(cè)視圖，S4和S5體系采用俯視圖，多肽的起始位置都被放置在距離膜表面相同距離的位置處。由圖結(jié)果可知，平衡后的4個(gè)體系中的構(gòu)象都發(fā)生了很大的改變：S2和S3體系的結(jié)果和2.2小節(jié)的分析一致，多肽S4(13)分子的兩端都被錨定在POPG膜上，而在POPC膜上只有一端被固定。S4體系的5個(gè)S4(13)分子在POPC膜上發(fā)生了聚集，傾向于形成四聚體結(jié)構(gòu)(圖S4(b))；S5體系的5個(gè)S4(13)分子和膜有較強(qiáng)的靜電相互作用，這限制了分子的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致S4(13)分子在POPG膜上不能發(fā)生聚集。S7水相體系的起始和平衡后的結(jié)構(gòu)和S8體系穩(wěn)定后的S4(13)結(jié)構(gòu)也證明多個(gè)S4(13)分子在水相中容易發(fā)生聚集形成四聚體(圖S4(a)、S4(c))。此外，游離在聚集體之外的單個(gè)S4(13)，因?yàn)闆]有形成聚集體結(jié)構(gòu)失去了螺旋結(jié)構(gòu)。S6體系由于水相中S4(13)分子運(yùn)動(dòng)較靈活且間隔較遠(yuǎn)，沒有形成四聚體，但是有形成四聚體結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)。通過觀察S7和S8體系的結(jié)果，也證明S4(13)在水相中有形成四聚體的傾向。

圖3 各個(gè)體系S4(13)骨架原子的回轉(zhuǎn)半徑隨模擬時(shí)間變化曲線Fig.3 The radius of gyration changes for backbone atoms of S4(13) in each system with simulation time

圖4 S2～S5體系模擬前的初始結(jié)構(gòu)和模擬后的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)Fig.4 The initial structures before simulations and the equilibrated structures after simulations for systems S2-S5

對(duì)S4、S5、S7和S8體系中S4(13)進(jìn)行殘基間接觸強(qiáng)度和軌跡相關(guān)系數(shù)的分析(圖5)，S4和S5接觸強(qiáng)度的結(jié)果和圖4一致，結(jié)合S7和S8體系的結(jié)果，說明S4(13)在POPG膜上不聚集，在POPC膜和水溶液環(huán)境下才會(huì)傾向于形成四聚體。S4、S7和S8體系相關(guān)系數(shù)的結(jié)果(圖5(e)、5(g)、5(h))與接觸強(qiáng)度的結(jié)果(圖5(a)、5(c)、5(d))一致，圖中4個(gè)S4(13)分子的相關(guān)性很強(qiáng)，S5體系由于S4(13)和質(zhì)膜表面有較強(qiáng)的結(jié)合作用，因此表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)的一致性，所以會(huì)存在4個(gè)分子運(yùn)動(dòng)相關(guān)性很強(qiáng)的情況(圖5(f))，這從另一方面說明了多個(gè)S4(13)分子和POPG膜的穩(wěn)定結(jié)合作用。

圖5 S4、S5、S7和S8體系S4(13)殘基間的接觸熱圖(a～d)和相關(guān)系數(shù)熱圖(e～h)Fig.5 The contact intensity maps (a-d) and correlation maps (e-h) for residues of S4(13) for systems S4, S5, S7, and S8

2.4 單分子和多分子S4(13)與不同質(zhì)膜作用時(shí)的構(gòu)象變化

文獻(xiàn)表明，S4(13)可以形成螺旋結(jié)構(gòu)，S4(13)在穿膜過程中伴隨著構(gòu)象的變化，這種結(jié)構(gòu)變化與S4(13)穿膜機(jī)理可能有聯(lián)系。常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果表明單個(gè)S4(13)分子和質(zhì)膜相互作用時(shí)，螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，氫鍵分析結(jié)果也表明分子內(nèi)氫鍵占有率極低。對(duì)各體系進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)隨模擬時(shí)間變化的分析(圖S6)，表2中顯示的是S1～S8體系每個(gè)S4(13)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的時(shí)間占比，S4～S8體系中S4(13)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化顯示，聚集體的α-螺旋比例較高，提示形成S4(13)分子聚集體有利于維持α-螺旋結(jié)構(gòu)。對(duì)單個(gè)S4(13)分子在POPC和POPG膜上的傘形采樣的軌跡進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明單個(gè)S4(13)分子嵌入到膜內(nèi)區(qū)域時(shí)傾向于維持螺旋結(jié)構(gòu)，在水相傾向于形成無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)，因此膜相疏水環(huán)境比水相環(huán)境更有利于單個(gè)多肽分子維持螺旋結(jié)構(gòu)，這對(duì)聚集體與質(zhì)膜的作用也具有很好的參考意義。

2.5 單個(gè)S4(13)分子與不同質(zhì)膜結(jié)合時(shí)的氫鍵相互作用

氫鍵是維持超分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要相互作用。在S4(13)與質(zhì)膜結(jié)合初期，分子內(nèi)氫鍵是維持螺旋結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，分子間氫鍵則對(duì)多肽與質(zhì)膜的結(jié)合發(fā)揮重要作用。統(tǒng)計(jì)S2和S3體系中S4(13)與質(zhì)膜作用的氫鍵，取出占有率靠前的氫鍵(表3、表4)，對(duì)于POPC的體系，主要是S4(13)分子的Ala-1和Trp-3殘基與質(zhì)膜形成氫鍵，因此只是肽鏈的一端與質(zhì)膜有較強(qiáng)的相互作用。對(duì)于POPG體系，Lys-9、Lys-12、Lys-4和Ala-1殘基參與形成氫鍵。從形成氫鍵的數(shù)量上對(duì)比，也進(jìn)一步證明了POPG和S4(13)分子的結(jié)合更強(qiáng)。綜上，S2和S3體系的氫鍵分析表明：靜電相互作用對(duì)于多肽與細(xì)菌質(zhì)膜的結(jié)合發(fā)揮了重要作用，帶負(fù)電的POPG質(zhì)膜更容易和帶正電的多肽S4(13)形成氫鍵；不帶電的POPC質(zhì)膜更傾向于和S4(13)的疏水殘基作用。這和前面單個(gè)S4(13)分子與不同質(zhì)膜作用的結(jié)果一致，也和S2和S3體系的結(jié)構(gòu)圖一致。

表2 各個(gè)體系模擬過程中S4(13)各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的占比 (體系有多個(gè)多肽的標(biāo)記為Pep1～5)Table 2 The proportion of second structure for S4(13) in each system during the simulation time(The systems with multiple peptides are listed as Pep1-5) %

表3 S2體系中S4(13)和POPC膜形成的氫鍵Table 3 The hydrogen bonds formed between S4(13) and POPC membrane for S2 system

對(duì)比單個(gè)S4(13)分子結(jié)合到質(zhì)膜表面的構(gòu)象變化，分析傘形采樣體系S4(13)與質(zhì)膜的分子間氫鍵相互作用(表S1、S2)和S4(13)分子內(nèi)氫鍵相互作用(圖S5)。POPC體系形成的分子間氫鍵比POPG體系形成的分子間氫鍵更穩(wěn)定一些，這與S4(13)結(jié)合在質(zhì)膜表面的情況不同，S4(13)在質(zhì)膜內(nèi)形成了更多與POPC質(zhì)膜的氫鍵作用，可能是膜內(nèi)的疏水環(huán)境導(dǎo)致。同樣，POPC和POPG膜體系的分子內(nèi)氫鍵的數(shù)量圖(圖S5)顯示在質(zhì)膜內(nèi)的數(shù)量要大于水相環(huán)境中的數(shù)量，因此在膜內(nèi)更容易維持螺旋結(jié)構(gòu)，在水相螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。在POPC膜內(nèi)S4(13)的分子內(nèi)氫鍵的數(shù)量更多。這些說明S4(13)在POPC膜內(nèi)更穩(wěn)定，這個(gè)結(jié)論和PMF曲線(圖2)給出的結(jié)論一致。

表4 S3體系中S4(13)和POPG膜形成的氫鍵Table 4 The hydrogen bonds formed between S4(13) and POPG membrane for S3 system

對(duì)于維系多個(gè)S4(13)體系聚集體存在相互作用的情況，S8體系聚集體之間的接觸強(qiáng)度(表S3)和分子間氫鍵分析(表S4)表明，聚集體之間的結(jié)合依賴于疏水殘基間的疏水相互作用。接觸強(qiáng)度可以看作一定距離內(nèi)所有作用力的集合，提取0.5 nm以內(nèi)的接觸強(qiáng)度大于50的相互作用殘基，表中顯示疏水性殘基對(duì)S4(13)分子聚集起著關(guān)鍵作用。S4和S7體系內(nèi)S4(13)分子間的接觸強(qiáng)度(表S5、表S6)進(jìn)一步證明了疏水殘基對(duì)于形成聚集體的重要性。

2.6 多個(gè)S4(13)分子在水相的聚集

為證明S4(13)分子能自發(fā)在水溶液中形成聚集體，進(jìn)行了傘形采樣動(dòng)力學(xué)模擬，得到平均力勢(shì)的結(jié)果如圖6(結(jié)構(gòu)圖表示反應(yīng)坐標(biāo)為1.0和2.0 nm處的S4(13)結(jié)構(gòu)，分別對(duì)應(yīng)于單個(gè)S4(13)分子和其他3個(gè)S4(13)分子結(jié)合最穩(wěn)定的狀態(tài)和完全遠(yuǎn)離聚集體結(jié)構(gòu)的狀態(tài)，其中疏水性氨基酸殘基顯示為紅色，親水性氨基酸殘基顯示為天藍(lán)色)。從圖中可知單個(gè)多肽從聚集體中解離需跨越的勢(shì)壘約為14.60 kJ/mol，這表明單個(gè)多肽在水相中形成聚集體是有利的，即S4(13)的聚集現(xiàn)象是普遍存在的。

圖6 水溶液體系傘形采樣模擬的平均力勢(shì)(PMF)曲線Fig.6 The PMF plots of umbrella sampling simulation for water system

3 結(jié)論

本文利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的手段，分析單個(gè)S4(13)和多個(gè)S4(13)在真核生物質(zhì)膜(POPC)和細(xì)菌質(zhì)膜(POPG)中發(fā)生的相互作用，模擬結(jié)果表明：POPG膜對(duì)S4(13)分子具有較強(qiáng)的吸引作用，可以約束S4(13)兩端的Ala-1和Ala-13殘基，并且與S4(13)多肽鏈中間部分的帶電殘基Lys-4、Lys-9和Lys-12有重要的相互作用，將多肽錨定在質(zhì)膜表面；而POPC膜對(duì)S4(13)的吸引作用較弱，只能吸引S4(13)分子一端的Ala-1、Leu-2和Trp-3殘基。S4(13)和質(zhì)膜的氫鍵分析表明靜電相互作用有利于多肽在質(zhì)膜界面的穩(wěn)定，而疏水相互作用有利于多肽在質(zhì)膜內(nèi)部的穩(wěn)定。S4(13)在POPC和POPG質(zhì)膜上的傘形采樣模擬表明單個(gè)S4(13)分子都可以和質(zhì)膜發(fā)生作用，被吸附到POPG膜上更容易，但都不容易穿過質(zhì)膜。多個(gè)S4(13)分子與不同質(zhì)膜的模擬結(jié)果表明S4(13)分子在水溶液和POPC膜上容易以四聚體的形式聚集，所以S4(13)分子更傾向于以聚集體的形式穿過生物膜。傘形采樣模擬的結(jié)果也表明在水相中容易發(fā)生S4(13)分子的聚集。分析殘基間的相互作用表明S4(13)聚集主要依賴于疏水性氨基酸殘基。另外，單個(gè)S4(13)分子在與質(zhì)膜作用的初始階段螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，但在膜內(nèi)能維持螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。當(dāng)S4(13)分子以聚集體形式存在時(shí)，螺旋結(jié)構(gòu)能較穩(wěn)定地存在。綜上，該研究結(jié)果為探究細(xì)胞穿膜肽和質(zhì)膜的作用提供了理論依據(jù)，這對(duì)于拓展細(xì)胞穿膜肽在臨床上的應(yīng)用有重要意義。