何孟纖，汪俊躍，孫玲偉，徐皆歡，吳彩鳳，張樹山，戴建軍，楊凱旋*，張德福*

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106）

精液冷凍保存技術(shù)是目前畜禽遺傳資源收集與保護(hù)中最有應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)之一，該技術(shù)已在多種哺乳動(dòng)物的保種和商業(yè)化推廣中得到廣泛應(yīng)用。在家禽上，精液冷凍雖已在其種質(zhì)資源保護(hù)中得到了部分應(yīng)用[1]，但存在凍后精子存活率低，輸精后種蛋孵化率不高等問題，因此，仍需對(duì)該技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化[2]。雞精液冷凍技術(shù)能最大限度地利用遺傳性能良好的種公雞，對(duì)禽類種質(zhì)資源的保護(hù)具有重要意義[3]。與哺乳動(dòng)物相比，禽類精子因結(jié)構(gòu)細(xì)長(zhǎng)，對(duì)冷凍損傷更為敏感，抗凍性較差[4]。近年來，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所對(duì)雞精子抗凍性基因進(jìn)行相關(guān)研究[5]。但到目前為止，家禽的精液冷凍技術(shù)尚未取得良好的效果，仍有待進(jìn)一步完善。

雞精液冷凍保存技術(shù)主要包括精液的采集、稀釋液的添加、精液平衡、精液冷凍、解凍和輸精。禽類精液是由精清和精子組成，但其化學(xué)成分與哺乳類動(dòng)物的精液差別較大，如禽類精液中幾乎不含果糖和檸檬酸，但含有粘多糖、葡萄糖和甘油等；家禽精子頭部直徑約為0.5 μm，其精子尾部直徑較頭部略小。精液冷凍過程中，一方面因精清中的成分不足以保護(hù)精子免受冷凍損傷[6]；另一方面因公雞一次射精量少，精液密度較高，需要適當(dāng)進(jìn)行稀釋[7]，因此研發(fā)高效冷凍稀釋液成為提高雞精液冷凍效果的關(guān)鍵因素。稀釋液中的果糖和葡萄糖可以為精子提供能量，鹽類物質(zhì)等也可以為精液提供合適的滲透壓和pH 環(huán)境[8]。目前，已有多種稀釋液應(yīng)用于雞精液冷凍保存，但不同研究結(jié)果差異較大?；诖?，本研究選擇6 種常用的、凍后效果較好的雞精液冷凍稀釋液，比較這6 種稀釋液對(duì)雞精子凍后活力、活率以及存活時(shí)間等的影響，篩選雞精液最佳基礎(chǔ)冷凍保護(hù)劑，為雞種質(zhì)資源的收集與保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 公雞來源 本研究使用的6 只公雞來源于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)站，品種為廣西容縣霞煙雞，22～30 周齡，健康狀況良好，精液質(zhì)量穩(wěn)定。

1.1.2 主要試劑 除特殊說明外，所有試劑均購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 精液采集 采用腹背按摩法[7]收集精液，將無糞便、雜物和血液污染的精液放入37 ℃水浴，鏡檢活力＞70 %的精液用于后續(xù)試驗(yàn)。在運(yùn)輸途中盡量避免劇烈晃動(dòng)和陽光直射。

1.2.2 稀釋液的配制 6 種基礎(chǔ)稀釋液分別為L(zhǎng)R[9]稀釋液、Lake’s[10]稀釋液、BPSE[11]稀釋液、Modified Sasaki[12]稀釋液、Beltsville[13]稀釋液和Nabi[14]稀釋液，組成成分詳見表1。冷凍稀釋液在基礎(chǔ)稀釋液的基礎(chǔ)上添加終含量為6%二甲基乙酰胺（dimethylacetamide，DMA）[15]。

表1 不同基礎(chǔ)稀釋液的配方Table 1 Formulations of different basic diluent

1.2.3 精液的稀釋與平衡 采用兩步法稀釋精液，首先將鏡檢合格精液混合（每次試驗(yàn)混合不少于5 只），測(cè)量體積后按照試驗(yàn)分組分為若干等分，按照1∶2 的稀釋比例加入等溫預(yù)熱的基礎(chǔ)稀釋液，用10層紗布包裹，避光放入4 ℃冰箱中平衡1 h[16]，再按照1∶1 的比例加入4 ℃預(yù)冷的冷凍稀釋液，繼續(xù)平衡10 min后裝管冷凍。

1.2.4 精液冷凍 將灌裝封口的0.5 mL 細(xì)管放入程序冷凍儀（Planer 公司，型號(hào)：Kryo 560-16）中并設(shè)定：5～-35 ℃時(shí)的降溫速率為7 ℃·min-1，-35～-120 ℃的降溫速率為9 ℃·min-1[17]，待冷凍結(jié)束后迅速投入到液氮中保存。

1.2.5 精液解凍 將裝有精液的0.5 mL 細(xì)管從液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴鍋中30 s 水浴解凍，解凍后用對(duì)應(yīng)的37 ℃基礎(chǔ)稀釋液按1∶1 的比例稀釋，并按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同保存溫度（4 和37 ℃）和時(shí)間（0、15、30、45、60、90 和120 min）進(jìn)行各項(xiàng)精液指標(biāo)檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每次每組至少解凍2管。

1.3 精子質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 精子活率與活力檢測(cè) 取10μL 解凍后的精液制片，使用精液自動(dòng)分析儀在顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察，使用Andro Vision 精液分析儀測(cè)定精子活力和活率。

1.3.2 精子質(zhì)膜完整率檢測(cè) 采用低滲腫脹法（hypoosmotic swelling test，HOST）檢測(cè)精子質(zhì)膜完整性[18]。配制HOST 低滲溶液，取10μL 精液樣品添加到100μL 等溫HOST 低滲溶液中，37 ℃水浴10 min，于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察不少于4 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)精子數(shù)不少于200 個(gè)，統(tǒng)計(jì)彎尾精子數(shù)和總精子數(shù)。兩者間的比值即為精子質(zhì)膜完整率。

1.3.3 精子頂體完整率檢測(cè) 采用吉姆薩染色法測(cè)定精子頂體完整率[19]。取適量解凍后精子涂片，風(fēng)干。甲醛固定15 min后沖洗干凈，吉姆薩溶液染色12 h，沖洗干凈，風(fēng)干后鏡檢。精子頂體結(jié)構(gòu)明顯染色，頂體完整、外形正?；蝽旙w輕微膨脹為頂體完整精子，頂體嚴(yán)重膨脹或頂體脫落為頂體畸形精子[20]，于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察不少于4個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)精子數(shù)不少于200 個(gè)，頂體完整精子數(shù)和總精子數(shù)兩者之間的比值即為精子頂體完整率。

分別使用碧云天的試劑盒檢測(cè)凍后精子的丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.3.4 精子線粒體活性檢測(cè) 采用羅丹明123（rhodamine 123,Rh123）染色檢測(cè)線粒體活性。取50 μL 精液樣本加入終濃度為100 nmol·L-1的染料，在暗處于37 ℃處理30 min。精子尾部呈現(xiàn)綠色熒光有線粒體活性，在熒光相差顯微鏡下觀察不少于4 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)精子數(shù)不少于200 個(gè)，統(tǒng)計(jì)尾部呈現(xiàn)綠色熒光的精子數(shù)、總精子數(shù)，兩者間的比值即為線粒體活性比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍稀釋液對(duì)雞精液凍后質(zhì)量的影響

精子解凍后立即對(duì)其進(jìn)行活率、活力和頂體完整率的檢測(cè)，結(jié)果（表2）表明，6 種不同稀釋液之間存在顯著性差異（P＜0.05）。在活率方面，Lake’s和LR稀釋液的凍后精子活率最高；Nabi次之；Beltsville最低。在活力方面，Lake’s和Nabi稀釋液的凍后精子活力最高，分別為45.70%和43.60%，顯著高于其他稀釋液。在頂體完整率方面，Lake’s 稀釋液最高，為45.26%；LR 和Nabi 次之，分別為41.33%和40.56%；Beltsville 最低，僅20.96%。綜上所述，Lake’s 稀釋液凍后精子的活率、活力和頂體完整性較高，Nabi次之；LR 雖獲得了較高的凍后活率，但精子活力較低；Beltsville稀釋液的冷凍效果最差。

表2 不同稀釋液下雞凍精的質(zhì)量Table 2 Quality of frozen chicken semen in different diluents

2.2 不同保存溫度對(duì)3種冷凍稀釋液凍后精子活率和活力的影響

由于BPSE、Modified Sasaki、Beltsville3 種基礎(chǔ)稀釋液雞精子凍后的活力和活率較低，因此，后續(xù)試驗(yàn)僅對(duì)LR、Lake’s、Nabi 基礎(chǔ)稀釋液進(jìn)行比較。

2.2.1 37 ℃條件下3種稀釋液凍后精子的活率和活力 LR、Lake’s、Nabi 稀釋液解凍后精子在37 ℃、2 h 內(nèi)的活率和活力如圖1 所示。在活率方面，LR 和Lake’s 稀釋液凍后精子的活率在解凍初始時(shí)顯著高于Nabi 稀釋液；但隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，LR 稀釋液的精子活率明顯下降，15 min 后顯著低于Lake’s 和Nabi 稀釋液。在活力方面，LR 和Nabi 稀釋液凍后精子活力在解凍初始時(shí)顯著低于Lake’s；隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，LR 稀釋液精子的活力則迅速下降，在15 min 后均顯著低于Lake’s 和Nabi 稀釋液；保存30～90 min，Nabi 稀釋液的精子活力略高于Lake’s，但差異不顯著；保存120 min后，Nabi稀釋液的精子活力高于Lake’s和LR。由此表明，Nabi 稀釋液在37 ℃條件下表現(xiàn)最佳，Lake’s稀釋液次之，LR稀釋液最差。

圖1 37 ℃條件下下3種稀釋液凍后精子的活率和活力Fig.1 Viability and motility of sperm frozen by 3 dilutions at 37 ℃

2.2.2 4 ℃條件下3 種稀釋液凍后精子的活率和活力 LR、Lake’s、Nabi 稀釋液解凍后精子在4 ℃、2 h 內(nèi)的活率和活力如圖2 所示，3 種稀釋液均表現(xiàn)為隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精子的活率和活力呈下降趨勢(shì)。其中，LR 稀釋液下降趨勢(shì)最為明顯，Lake’s稀釋液次之，Nabi稀釋液的耐保存性能最佳。在4 ℃保存條件下，Lake’s 和Nabi 稀釋液凍后精子的活率和活力隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)均無顯著差異，其精子活率在保存60 min 后分別為31.75 %和31.60 %，活力在保存45 min 也仍保持在30%以上。與37 ℃保存相比較，4 ℃保存可使精子保持更高的活率和活力。

圖2 4 ℃條件下3種稀釋液凍后精子的活率和活力Fig.2 Viability and motility of sperm frozen by 3 dilutions at 4 ℃

2.3 不同保存溫度對(duì)凍后精子線粒體活性和質(zhì)膜完整性的影響

不同溫度保存下凍后精子線粒體活性如表3所示。解凍初始，LR、Lake’s 和Nabi 稀釋液中高線粒體活性的精子比例分別為43.52%、43.72%和41.27%，三者間差異不顯著（P＞0.05）。在37 ℃條件下保存15和30 min時(shí)，Lake’s和Nabi稀釋液中精子的線粒體活性均顯著高于LR 稀釋液（P＜0.05）。在4 ℃條件下保存30 min 后，Lake’s和Nabi 稀釋液中精子的線粒體活性分別為32.09%和31.00%，顯著高于LR（P＜0.05），且明顯高于37 ℃條件下精子的線粒體活性（25.42%，27.17%和21.02%）。綜上所述，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種稀釋液中精子的線粒體活性均呈下降趨勢(shì)，而37 ℃條件下保存，降幅更大。多因素方差分析結(jié)果顯示，稀釋液類型、保存溫度和保存時(shí)間對(duì)凍后精子的線粒體活性影響極顯著（P＜0.01）。

不同溫度保存下凍后精子的質(zhì)膜完整性如表3 所示。解凍初始，LR 和Lake’s 稀釋液精子的質(zhì)膜完整率顯著高于Nabi 稀釋液。在37 ℃條件下保存15 和30 min，Lake’s 和Nabi 稀釋液中精子的質(zhì)膜完整率均顯著高于LR 稀釋液（P＜0.05）。在4 ℃條件下保存30 min 后，Lake’s 稀釋液中精子的質(zhì)膜完整率為37.56%，顯著高于Nabi 和LR 稀釋液（P＜0.05），且明顯高于37 ℃保存條件下的質(zhì)膜完整率。綜上所述，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種稀釋液的質(zhì)膜率均呈下降趨勢(shì)，而37 ℃條件下保存，降幅更為明顯。多因素方差分析結(jié)果顯示，稀釋液類型、保存溫度和保存時(shí)間對(duì)凍后精子的質(zhì)膜完整性影響極顯著（P＜0.01）。

表3 不同保存溫度條件下3種稀釋液凍后精子的線粒體活性、質(zhì)膜完整性Table 3 Mitochondrial activity and plasma membrane integrity of sperm frozen by 3 dilutions at different storage temperatures

2.4 不同保存溫度對(duì)不同稀釋液精液抗氧化性的影響

不同保存溫度下凍后精液的抗氧化性如表4所示。在MDA 含量上，Lake’s稀釋液凍后精液在初始解凍時(shí)MDA 含量最低，為7.23 nmol·L-1，但與LR 和Nabi 稀釋液差異不顯著（P＞0.05）；隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種稀釋液的MDA 含量均呈上升趨勢(shì)；Lake’s 稀釋液處理的精液在37 和4 ℃條件下保存30 min 后，MDA 含量分別為10.43 和9.73 nmol·L-1，均顯著低于LR 和Nabi 稀釋液，且4 ℃條件下保存時(shí)，MDA 含量的上升速度較慢。在SOD 活性上，Lake’s 稀釋液凍后精液在初始解凍時(shí)SOD 活性最高，為119.72 U·mL-1，但與LR 和Nabi 稀釋液差異不顯著（P＞0.05）；隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種稀釋液的SOD 活性均呈下降趨勢(shì)；Lake’s 和Nabi 稀釋液處理的精液在37 和4 ℃條件下保存30 min 后，SOD 活性分別為102.02、103.26 和109.91、113.05 U·mL-1，均顯著低于LR稀釋液（P＜0.05）；且4 ℃保存時(shí)SOD 活性的下降速度變慢。多因素方差分析結(jié)果顯示，稀釋液種類、時(shí)間和溫度間的互作對(duì)精液SOD 活性影響極顯著（P＜0.01）。

表4 不同保存溫度條件下3種稀釋液凍后精子的丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性Table 4 MDA content and SOD activity of sperm frozen by 3 dilutions at different storage temperatures

3 討論

稀釋液組成與精子凍后保存效果關(guān)系密切。本研究對(duì)6 種稀釋液凍后精子的活率、活力等指標(biāo)進(jìn)行分析比較，Lake’s稀釋液凍后精子的活率、活力、頂體完整性、質(zhì)膜完整性、線粒體活性優(yōu)于其他稀釋液；Nabi 稀釋液的凍后活率、活力低于Lake’s 和Nabi 稀釋液，但其表現(xiàn)為最佳的凍后耐保存性。由此說明，稀釋液保存效果的優(yōu)劣與稀釋液的成分、滲透壓、pH等關(guān)系密切。

3.1 滲透壓對(duì)雞精子凍后活率、活力的影響

滲透壓是雞精液冷凍稀釋液的重要參數(shù)，一般為295～360 mOsm·kg-1。張兆旺等[21]研究表明，在等滲或接近等滲的稀釋液中雞精子凍后效果最優(yōu)。王世銀等[22]研究表明，滲透壓為360～440 mOsm·kg-1時(shí)更有利于雞精液冷凍保存時(shí)精子的存活和保存后的受精力。合適的滲透壓可以緩解冷凍和解凍過程對(duì)精子造成的損傷。本研究中，冷凍效果較好的Lake’s和Nabi稀釋液的滲透壓分別為333 和310 mOsm·kg-1，屬于較低的滲透壓；Modified Sasaki稀釋液的滲透壓為415 mOsm·kg-1，凍后精子的活率和活力均顯著低于Lake’s 和Nabi 稀釋液，由此推測(cè)，較高的滲透壓可能不利于雞精液的冷凍保存。

3.2 pH對(duì)雞精子凍后活力、活率的影響

精液稀釋液的pH 對(duì)精子保存非常重要。精子運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)，能量消耗快，因此，產(chǎn)生的大量代謝物使精液pH 降低，從而抑制一些酶活性，導(dǎo)致精子活力、活率降低，影響其受精能力[23]。丁瑜[24]認(rèn)為pH 過高會(huì)影響精液凍后活性。一般雞精液稀釋液的pH 為7.2～7.6。姚希芳[25]研究顯示，當(dāng)pH為6.7～7.2 時(shí)，精子存活時(shí)間最長(zhǎng)。在本試驗(yàn)中，冷凍效果最好的LR、Lake’s 和Nabi 稀釋液的pH分別為7.0、7.0 和7.4，均屬于較為理想的稀釋液pH；Nabi 稀釋液表現(xiàn)為最佳的凍后耐保存性能，可能與其pH 較高有關(guān)；Beltsville 稀釋液的pH 為7.5，其冷凍效果較差，由此推測(cè)，較高的pH 可能不利于提高家禽的精液冷凍保存效果。

3.3 稀釋液成分對(duì)雞精子凍后活力、活率的影響

不同稀釋液成分對(duì)精子凍后活力、活率的影響不同。楊小霞等[26]和金美林等[27]研究顯示，在稀釋液中添加果糖比添加葡萄糖效果好。張兆旺[28]研究表明，在稀釋液中添加谷氨酸鈉對(duì)精液有保護(hù)作用。王世銀等[29]研究顯示，稀釋液中的糖類物質(zhì)對(duì)精子質(zhì)膜起到保護(hù)作用。姚希芳[25]研究顯示，糖類物質(zhì)和谷氨酸鈉能夠給精子提供能量，并對(duì)精子起到保護(hù)作用。王秀萍等[30]研究表明，少量的K+可延長(zhǎng)精子的壽命。張彩云等[31]研究表明，過量K+會(huì)抑制精子活性，影響精子活力。Mg2+是參與多種酶促反應(yīng)的重要輔因子，在精子發(fā)生和調(diào)節(jié)精子活力中發(fā)揮重要作用。在本研究中，BPSE 稀釋液中K+過高，且Mg2+缺乏；Lake’s、Nabi和LR稀釋液中K+和Mg2+含量適中，有利于凍后精子保有較高的活力、活率和頂體完整性。

3.4 保存溫度對(duì)雞精子凍后活力、活率的影響

在精液保存過程中，溫度對(duì)精子的保存效果有重要影響。雞精子運(yùn)動(dòng)較快，呼吸作用會(huì)產(chǎn)生大量代謝物，低溫保存可抑制精子活性，使精子活動(dòng)減弱，降低代謝速率，從而減少酸性物質(zhì)的累積[32]。1967 年，Van Wambeke[33]首次證明精子在5 ℃下保存24 h 后仍具有受精能力。姚希芳[25]和張兆旺等[21]證明雞精液在3～5 ℃中保存效果最優(yōu)。本研究比較了Lake’s、Nabi、LR 3種稀釋液凍后在4和37 ℃保存下精子的活性，結(jié)果表明，保存于4 ℃條件下的精子在活率、活力、頂體和質(zhì)膜完整性等均高于37 ℃。

3.5 不同稀釋液對(duì)精子抗氧化指標(biāo)的影響

精子在冷凍保存過程中，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境會(huì)發(fā)生較大變化，導(dǎo)致精子產(chǎn)生過量的活性氧，破壞精子自身的抗氧化系統(tǒng)。適當(dāng)?shù)膒H 和滲透壓有利于維持精子正常的代謝活動(dòng)，減少精子的氧化損傷。王世銀等[32]研究表明，稀釋液中緩沖物質(zhì)濃度過低或過高都會(huì)使精子受到損傷，從而增加精子畸形率，破壞精子自身的抗氧化系統(tǒng)。精液中添加磷酸鹽、檸檬酸鹽等成分可抵消精子代謝產(chǎn)生的大量酸性物質(zhì)[34]，減少精子的氧化損傷。隨著凍后精液保存時(shí)間的延長(zhǎng)，如保存溫度過高，精子代謝會(huì)消耗大量能量物質(zhì)，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量的代謝廢物，如乳酸、活性氧等，進(jìn)而影響精子活力和受精能力[25,35]。本研究表明，Lake’s稀釋液在抗氧化性能上優(yōu)于其他稀釋液，且4 ℃條件保存優(yōu)于37 ℃保存。