李倩曉 那榮妹 劉百亭 于 勤

(杭州市紅十字會醫(yī)院，浙江 杭州 310000)

SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)條件的選擇

李倩曉 那榮妹1劉百亭1于 勤1

(杭州市紅十字會醫(yī)院，浙江 杭州 310000)

目的 探討分離及培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的最佳條件。方法 選取不同周齡(2、3、4、8 w)的SD大鼠；采用全骨髓貼壁篩選法對不同的培養(yǎng)基(L-DMEM、DMEM/F12)，血清體積分?jǐn)?shù)(7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%)，首次換液時(shí)間(48、72、96 h)，換液方法(全換液、半換液)分組進(jìn)行培養(yǎng)，每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目的變化，細(xì)胞融合80%～90%時(shí)進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，記錄達(dá)到傳代要求的時(shí)間，取第三代細(xì)胞繪制BMSCs生長曲線，各組間免疫熒光檢測CD34、CD44的表達(dá)率。結(jié)果 ①第2～3周SD大鼠達(dá)到傳代要求時(shí)BMSCs數(shù)目最多、所需時(shí)間最短，第8周BMSCs含量明顯減少，難以形成集落生長，細(xì)胞融合不到50%；DMEM/F12培養(yǎng)基中的細(xì)胞貼壁早、活性強(qiáng)，L-DMEM培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長緩慢，兩組相比差異顯著(P<0.05)；72 h全換液和48 h半換液組細(xì)胞數(shù)目多，二者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，24 h全換液細(xì)胞數(shù)目少，72 h半換液雜細(xì)胞多，細(xì)胞呈全分布，二者增值速度慢，與前者相比差異顯著(P<0.05)；體積分?jǐn)?shù)越高細(xì)胞生長分化越快，時(shí)間越短，但各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，傳代培養(yǎng)中高體積分?jǐn)?shù)的細(xì)胞易老化。②接種圓形BMSC培養(yǎng)6 h后貼壁，分化成圓形、類圓形或多角形；72 h后有少量短梭形、星形細(xì)胞分散、貼壁生長，部分細(xì)胞伸出一支或多支偽足，類似于成纖維細(xì)胞；約6 d后BMSCs細(xì)胞集落呈放射狀排列,伸出長短及粗細(xì)均不規(guī)則，伴形態(tài)各異的偽足、細(xì)胞胞核大、核仁清晰；約10 d細(xì)胞能融合80%～90%培養(yǎng)面；傳代后24 h內(nèi)可見細(xì)胞已完全貼壁，3 d可見以梭形為主的細(xì)胞鋪滿80%～90%培養(yǎng)面；經(jīng)過1～2次傳代后，細(xì)胞呈放射狀或平行排列，形態(tài)趨于一致。③傳代2 d后，細(xì)胞緩慢生長，處于生長停滯期；3 d起細(xì)胞轉(zhuǎn)入對數(shù)生長期，4～5 d至高峰后轉(zhuǎn)入平臺期，細(xì)胞倍增時(shí)間約39.5 h。④傳代BMSc存在CD44抗原表達(dá)，陽性率98.3%，而CD34呈陰性表達(dá)。結(jié)論 全骨髓貼壁篩選法是一種獲得高純度BMSCs簡單、有效的方法；在適宜的培養(yǎng)條件下(SD大鼠育齡為2～3 w，接種密度80%～90%培養(yǎng)面，培養(yǎng)基為DMEM/F12，合適血清體積分?jǐn)?shù)為10%，72 h首次全換液)BMSCs在體外生長狀態(tài)良好，增殖速度快，DAPI可作為標(biāo)記BMSCs的一種有效手段，也可作為細(xì)胞免疫組化的基礎(chǔ)染色。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；原代培養(yǎng)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種骨髓基質(zhì)內(nèi)分布的經(jīng)中胚層細(xì)胞分化而來的細(xì)胞亞群,其來源廣泛，有多種分化潛能和低免疫原性，可分離及體外擴(kuò)增為各類骨骼、組織、器官細(xì)胞及造血干細(xì)胞等的基質(zhì)細(xì)胞〔1〕，是組織工程首選種子細(xì)胞〔2〕?，F(xiàn)今，BMSCs體外擴(kuò)增和純化趨于成熟，培養(yǎng)條件參差不齊，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)旨在比較各種培養(yǎng)條件，初步確定BMSCs體外培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)，對其體外培養(yǎng)過程中注意事項(xiàng)加以說明。

1 材料和方法

1.1 材料 2、3、4、8周齡清潔級SD大鼠。主要試劑：L-DMEM 、DMEM /F12、胰蛋白酶、雙抗(美國 Thermo 公司),DAPI(美國Sigma 公司),胎牛血清(天津TBD公司),兔抗大鼠CD44、CD34抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、四甲基偶氮唑鹽。主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(北京安捷來科學(xué)儀器設(shè)備有限公司)，超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)，醫(yī)用離心機(jī)(長沙湘銳離心機(jī)有限公司TDZ5-BP)，激光共聚焦顯微鏡(COIC XDS-1B) ，移液槍(Dragon DX20284、DP31238)，試管、吸管、培養(yǎng)瓶25 cm3(美國Corning)，儲物柜(洛陽市宇龍辦公機(jī)具有限公司)，冰箱(Hisense)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠BMSCs分離和培養(yǎng) 大鼠斷頸處死后置于碘伏內(nèi)泡3～5 min，取出75%乙醇脫碘。無菌條件下用生理鹽水沖洗干凈，剝離、脫下雙下肢皮膚，取下雙下肢后用生理鹽水沖洗，將股骨、脛骨剝離和干骺端剪除，用5 ml注射器吸、注磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗骨髓腔5～10次，收集沖洗液于培養(yǎng)皿內(nèi)后吹打混勻，1 200 r/min離心 5 min，棄上清液。根據(jù)各組要求制備細(xì)胞懸液，置于高倍鏡下調(diào)整細(xì)胞濃度，至細(xì)胞鋪滿目鏡視野80%～90%止，液體裝瓶(4 ml/瓶)后接種于25 cm3培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2下培養(yǎng)。根據(jù)不同培養(yǎng)基、血清體積分?jǐn)?shù)、首次換液時(shí)間、換液方法分組接種培養(yǎng)。半換液后24 h全換液，首次換液后每隔3 d換液一次，細(xì)胞鋪滿80%～90%培養(yǎng)面時(shí)消化傳代，記錄原代培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞數(shù)目。

1.2.2 細(xì)胞分組 按照培養(yǎng)基、血清體積分?jǐn)?shù)、首次換液時(shí)間、首次換液方法分為4組，每組兩瓶細(xì)胞。(1)不同培養(yǎng)基:采取全骨髓貼壁法，以細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)面80%～90%密度進(jìn)行接種，分別使用10% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基、10%FBS-L-DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，首次換液時(shí)間為72 h并采取全換液，以后每隔3 d換液一次。(2)不同血清體積分?jǐn)?shù):采取全骨髓貼壁法，以細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)面80%～90%密度進(jìn)行接種，分別在血清體積分?jǐn)?shù)為7.5%、10%、12.5%、15%的DMEM/F12培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，首次換液時(shí)間為72 h并采取全換液，以后每隔3 d換液一次。(3)不同換液方法:采取全骨髓貼壁法，以細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)面80%～90%密度進(jìn)行接種，10%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，首次換液時(shí)間為72 h，分別行全換液、半換液，以后每隔3 d換液一次。(4)不同換液時(shí)間:采取全骨髓貼壁法，以細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)面80%～90%密度進(jìn)行接種，10%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，分別于48、60、72 h進(jìn)行全換液，以后每隔3 d換液一次。

1.2.4 細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)間計(jì)算及傳代方法 記錄各組達(dá)到80%～90%融合時(shí)的原代培養(yǎng)時(shí)間并進(jìn)行消化，懸浮細(xì)胞后按1∶2比例傳代。

1.2.5 大鼠BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 原代及傳代BMSCs置于倒置顯微鏡下，400倍觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.6 傳代BMSCs生長曲線繪制并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間 取培養(yǎng)至3代、生長良好的細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×103個(gè)/ml接種于96孔板(200 μl/孔)，5%CO2、100%濕度和37℃培養(yǎng)24 h。每天固定時(shí)間取3孔滴入5 μg/μl MTT 液20 μl，37℃孵育4 h后去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔滴入150 μl二甲基亞砜(DMSO)振蕩均勻至結(jié)晶物完全顯色，用京德鐵HBS-1096A 酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)測定細(xì)胞570 nm處測吸光度(A570)值，取3次平均值代表細(xì)胞相對數(shù)量，并以橫坐標(biāo)=時(shí)間(d)，縱坐標(biāo)=OD值(細(xì)胞相對數(shù)量)繪制生長曲線。細(xì)胞倍增時(shí)間(TD)=t×log 2/(log Nt-log N0)。t：培養(yǎng)時(shí)間，N0：接種后細(xì)胞數(shù)，Nt：培養(yǎng)t h后細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 傳代BMSCs的DIPA標(biāo)記及免疫組化鑒定 取培養(yǎng)至3代、生長良好的細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，接種至預(yù)先放置無菌蓋玻片6孔板內(nèi)，培養(yǎng)4～5 d，待蓋玻片80%～90%表面被細(xì)胞鋪滿后，PBS沖洗3次，10 min/次，室溫下滴入4%多聚甲醛40 g/L固定30 min，PBS沖洗，滴入0.2%TritonX-100 2 ml/L通透細(xì)胞,37℃下封閉30 min，滴加一抗(兔抗大鼠CD44及CD34單克隆抗體，稀釋濃度1∶100),37℃下孵育2 h，PBS沖洗3次，10 min/次，滴加二抗(RBITC標(biāo)記山羊抗兔IgG，稀釋濃度1∶100)，37℃孵育1 h，PBS沖洗3次，10 min/次，將無菌DAPI儲存液滴入MSCs上清液中調(diào)整終濃度至50 mg/L，37℃、5%CO2孵育2 h后封片，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。陽性細(xì)胞：胞體呈紅色熒光、細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；陰性細(xì)胞：胞體和胞核呈藍(lán)色熒光。隨機(jī)選取10組視野計(jì)算陽性率，每組取3次計(jì)數(shù)平均值，10組平均值為MSCs純度。

1.2.8 觀察不同培養(yǎng)條件對BMSCs生長的影響 倒置顯微鏡下觀察和記錄各組原代及傳代BMSCs形態(tài)變化、細(xì)胞達(dá)到傳代時(shí)間，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間；免疫組織化學(xué)法測定BMSCs CD44、CD34表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BMSCs原代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察 剛接種細(xì)胞形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為大小不等的圓形及橢圓形，密集懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)，折光性較強(qiáng)；培養(yǎng)6～8 h后貼壁，呈紡錘狀或類圓形，24 h后少量細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞呈紡錘形、三角形、多邊形或不規(guī)則形等多種形態(tài)，72 h內(nèi)細(xì)胞基本完成貼壁，長梭形或紡錘形細(xì)胞明顯增多，但是仍以三角形、多角形為主，未貼壁細(xì)胞仍懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)；3 d后全換液，棄去懸浮的未貼壁細(xì)胞。隨后貼壁細(xì)胞開始分裂增殖，6～8 d后可見貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞形態(tài)主要為長梭形或紡錘形，部分為短梭形或三角形，呈集落樣增殖。其后集落逐漸增大鋪開，9～11 d后貼壁細(xì)胞可基本鋪滿培養(yǎng)瓶底，見圖1～3。傳代后接種12 h后，絕大部分細(xì)胞貼壁、生長迅速，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為梭形，24 h后100%貼壁，4～5 d即可鋪滿瓶底，細(xì)胞為細(xì)長梭形呈漩渦狀或魚群樣排列。傳代1～2次后，細(xì)胞表現(xiàn)為單一梭形成纖維樣，放射狀或平行排列。傳至P3代后，顯微鏡下可見極少量雜質(zhì)細(xì)胞，連續(xù)傳數(shù)代細(xì)胞形態(tài)類似傳代細(xì)胞。見圖1。

原代培養(yǎng)第3天

原代培養(yǎng)第6天

原代培養(yǎng)第9天

傳代后第5天 圖1 大鼠BMSCs原代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察(×200)

2.2 不同培養(yǎng)條件對BMSCs生長的影響 (1)不同培養(yǎng)基:細(xì)胞在DMEM/F12中培養(yǎng)增殖速度快，細(xì)胞分化快，達(dá)到傳代培養(yǎng)時(shí)間短，高倍視野下細(xì)胞數(shù)(412.54±12.72),細(xì)胞80%～90%融合時(shí)間為11 d;在L-DDMEM中培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)為(340.27±14.31)，融合時(shí)間13,組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)不同血清體積分?jǐn)?shù):10%～15%血清濃度各組間相比細(xì)胞數(shù)目相似(10%:412.54±12.72,12.5%:420.54±13.34,15%:462.00±7.82)，細(xì)胞增殖快(融合時(shí)間分別為11 d、11 d、10 d)，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與7.5%血清濃度比較(287.78±10.22;15 d)差異顯著(P<0.05)。(3)不同換液時(shí)間及方法:48 h全換液難以達(dá)到細(xì)胞80%～90%融合的要求，細(xì)胞總數(shù)為124.62±4.23；48 h半換液及72 h全換液細(xì)胞達(dá)到傳代時(shí)間最短(均11 d)，細(xì)胞總數(shù)多(390.85±12.67,412.54±12.72)，組間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；72 h半換液與其相比細(xì)胞數(shù)目少(324.52±6.45)，融合時(shí)間長(13 d)(P<0.05)。

2.3 傳代BMSCs生長曲線測定 傳代細(xì)胞開始1～2 d細(xì)胞生長緩慢，處于生長潛伏期;3～5 d為細(xì)胞生長快速至對數(shù)增長期;6 d后增殖平緩期;8 d達(dá)平臺期，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間為39.5 h。

2.4 傳代BMSCs的免疫鑒定 染色后全部BMSCs細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，>90%胞體呈紅色熒光。經(jīng)CD34抗體和DAPI染色后熒光顯微鏡下見所有BMSCs細(xì)胞核均被標(biāo)記藍(lán)色熒光，細(xì)胞膜無熒光顯示。表明傳代的細(xì)胞CD44抗原呈陽性表達(dá)CD34抗原呈陰性表達(dá)。

3 討 論

在骨髓中BMSCs的含量較低，與骨髓單核細(xì)胞比大約為1∶100 000，數(shù)量隨年齡增長不斷減少〔3〕，其體外易培養(yǎng)、大量增殖并可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞等，具有多分化的潛能，而且避免了胚胎干細(xì)胞應(yīng)用的倫理學(xué)爭議。目前BMSCs體外培養(yǎng)條件各異，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基種類、種植密度、血清體積分?jǐn)?shù)等均能影響到BMSCs的體外生長，因此只有尋找到最適培養(yǎng)條件，才有利于獲取更高質(zhì)量的BMSCs。

分離純化BMSCs的方法主要包括全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠法。流式細(xì)胞技術(shù)和免疫磁珠法可致較高的細(xì)胞丟失量，操作復(fù)雜、費(fèi)用較高〔4〕，因此全骨髓貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法應(yīng)用范圍較廣。全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)法具有操作快速、效果可靠、簡便穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，相比之下更優(yōu)于密度梯度離心法〔5〕。骨髓內(nèi)BMSCs較其他細(xì)胞更易貼壁，這是因?yàn)樵煅杉?xì)胞可釋放生長因子及相關(guān)促貼壁介質(zhì),引導(dǎo)BMSCs貼壁生長〔6〕,因此利用骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁快，72 h內(nèi)基本上完全貼壁，獲得的細(xì)胞活性好、增殖力較強(qiáng)。雖然初始獲取的BMSCs純度較低，雜質(zhì)細(xì)胞含量多，但是通過反復(fù)的換液和傳代的方法可以除去雜質(zhì)細(xì)胞并逐步純化BMSCs，第三代BMSCs純度可以接近100%。

L-DMEM和DMEM/F12是BMSCs培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基，二者均能促進(jìn)BMSCs的生長和增殖，原代培養(yǎng)過程中DMEM/F12培養(yǎng)基中細(xì)胞增殖速度快，細(xì)胞總數(shù)明顯大于L-DMEM培養(yǎng)基(P<0.05)；L-DMEM培養(yǎng)基中細(xì)胞貼壁亦較好，但是細(xì)胞活性差，顆粒含量重，諸如換液、胰酶消化等外界環(huán)境的輕微變化即可引起細(xì)胞的死亡。原因可能與DMEM/F12中營養(yǎng)成分相關(guān)，DMEM/F12是DMEM和F12的1∶1混合制劑，具有F12含有較豐富的成分和DMEM含有較高濃度的營養(yǎng)成分的雙重優(yōu)勢，同時(shí)含有鐵、銅、鈣等金屬離子及HEPES緩沖成分，更適宜BMSCs的體外培養(yǎng)。采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液中含紅血細(xì)胞、白細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、造血干細(xì)胞等多種細(xì)胞成分，細(xì)胞形態(tài)、大小各異，顯微鏡下難以計(jì)數(shù)，選取2～3 w SD大鼠雙側(cè)股骨及脛骨骨髓制成細(xì)胞懸液后接種3瓶25 cm3，以高倍鏡細(xì)胞體滿80%～90%培養(yǎng)面為宜，如接種2瓶則可見細(xì)胞全部鋪滿培養(yǎng)面，部分細(xì)胞相互重疊，接種密度過大；如接種4瓶，細(xì)胞總數(shù)少。換液后二者貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯少于前者，其原因可能是細(xì)胞接種密度過大，大量細(xì)胞貼壁，包括非BMSCs，營養(yǎng)大量消耗的同時(shí)細(xì)胞之間存在相互競爭，抑制周圍細(xì)胞的增殖；但是如果接種密度過低，細(xì)胞本身數(shù)目少，造血干細(xì)胞分泌的生長因子和促貼壁物質(zhì)不足，BMSCs之間缺乏相互刺激，難以形成集落生長。不同體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)結(jié)果的原因可能是高濃度的血清營養(yǎng)含量大，更能促進(jìn)細(xì)胞增殖和貼壁生長，但是過高的胎牛血清濃度也能促進(jìn)細(xì)胞過早分化〔7〕，因此10%血清濃度的培養(yǎng)基在節(jié)約成本本的同時(shí)既能滿足細(xì)胞正常的生長繁殖又能連續(xù)傳代。原代培養(yǎng)首次換液時(shí)間對BMSCs生長增殖一定影響〔8〕，而首次換液時(shí)采用半量換液的方法，有助于保留部分貼壁不緊密的細(xì)胞〔9〕，本研究說明BMSCs在24 h時(shí)仍有部分未貼壁，在72 h時(shí)已貼壁完全。

現(xiàn)今，研究尚未確定統(tǒng)一的BMSCs特異性抗原表型〔10〕，但是其表面分子內(nèi)存在間質(zhì)、內(nèi)皮、上皮和肌肉細(xì)胞特征〔11〕，而且體外擴(kuò)增的BMSCs不表達(dá)造血細(xì)胞的CD34、CD45 或CD14 等分子〔12〕，常規(guī)間接鑒定BMSCs以排除法為準(zhǔn)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)得到的BMSCs對塑料器皿具有貼附特性；免疫組化結(jié)果表明本研究分離培養(yǎng)大鼠骨髓細(xì)胞分化為骨髓BMSCs。

綜合上述，BMSCs傳至P3代時(shí)雜質(zhì)細(xì)胞基本消失，細(xì)胞形態(tài)呈均勻分布、單一、梭形成纖維樣細(xì)胞。

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〔2016-10-31修回〕

(編輯 郭 菁)

杭州市醫(yī)療衛(wèi)生及重點(diǎn)?？茖２】瓶蒲泄リP(guān)專項(xiàng)(20140733Q26)

于 勤(1966-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科的臨床科研和教學(xué)工作。

李倩曉(1986-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科的臨床研究。

R3

A

1005-9202(2017)05-1084-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.020

1 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院