侯維娜 王瑞鵑 王鵬飛 侯瑞田 董文超 丁振江

(承德醫(yī)學院，河北 承德 067000)

血管緊張素Ⅱ對血管內皮細胞線粒體轉錄因子A表達的影響

侯維娜 王瑞鵑1王鵬飛1侯瑞田1董文超1丁振江1

(承德醫(yī)學院，河北 承德 067000)

目的 探討血管緊張素(Ang)Ⅱ對血管內皮細胞線粒體轉錄因子A(TFAM)表達及細胞功能的影響。方法 將不同濃度的Ang Ⅱ(1×10-7～1×10-5mol/L)與原代人臍靜脈細胞(HUVECs)共孵育，在24 h用免疫印跡技術和RT-PCR分別檢測TFAM的表達量；在12 h用流式細胞儀檢測線粒體膜電位及細胞的凋亡率變化。結果 Ang Ⅱ以濃度依賴的方式降低TFAM的表達量；隨著Ang Ⅱ濃度升高，線粒體膜電位降低水平、細胞凋亡率增加(P<0.01)。結論 Ang Ⅱ降低HUVECs TFAM表達量及導致細胞損傷。

血管緊張素Ⅱ；人臍靜脈內皮細胞；線粒體轉錄因子A

血管緊張素(Ang)Ⅱ作用于內皮細胞后可產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，ROS大量累積引起的氧化應激會導致細胞損傷，尤其是早期對線粒體的影響可貫穿動脈粥樣硬化(AS)病變產(chǎn)生的早期階段〔1～3〕。適量的ROS可上調存活途徑增強抗氧化應激基因的表達；隨著其濃度的升高，可誘導DNA損傷，甚至細胞凋亡。有研究顯示，線粒體轉錄因子A(TFAM)在一定程度上可對抗ROS產(chǎn)生的氧化應激，使細胞免受損傷〔4〕，但是高濃度的ROS可抑制TFAM表達，導致線粒體功能障礙，甚至引起細胞死亡。本實驗將不同濃度的AngⅡ作用于內皮細胞，觀察內皮細胞中TFAM的表達及細胞的功能變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 原代臍靜脈內皮細胞(HUEVCs,ScienCell)，Ang Ⅱ(Millipore Corporation)，完全培養(yǎng)基(ScienCell，Catalog Number：1001)，單克隆兔抗人一抗(Abcam)，山羊抗兔二抗(KPL)，Trizol(ambion)，F(xiàn)astQuant RT Kit(with gDNA)第一鏈合成系統(tǒng)試劑盒(TIANGEN 公司)，SuperRealPreMixPlus(SYBR Green)試劑盒(TIANGEN 公司)，引物設計合成(TaKaRa Biotechnology公司)，檢測細胞膜電位試劑盒(SIGMA-ALDRICH)，凋亡試劑盒(BD)，DYY-III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，RT-PCR 擴增儀(Roche公司)，流式細胞儀(CYTOMICS FC 500)。

1.2 HUVES細胞培養(yǎng) 將原代細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，用ScienCell公司的內皮培養(yǎng)基隔1 d換液1次，培養(yǎng)至6～7代時取對數(shù)生長期的細胞用于實驗，細胞消化液為0.25%+EDTA的胰蛋白酶。

1.3 不同濃度的Ang Ⅱ對HUVECs的影響 收集對數(shù)生長期的HUVECs細胞，調至1×106/ml接種于6孔板培養(yǎng)12 h，加入藥物終濃度為10-7、10-6、10-5mol/L的Ang Ⅱ作為實驗組(分別為B、C、D組)，對照組(A組)不加藥物。實驗組和對照組均在于不加血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

1.3.1 Western印跡檢測細胞TFAM蛋白表達 提取蛋白，進行BCA蛋白定量，煮沸蛋白，配膠，加樣后進行電泳、轉膜、封閉。將膜置于TFAM、β-actin一抗中4℃孵育過夜，洗膜后將膜置于二抗中孵育2 h。曝光，定影，掃描膠片并用軟件進行分析。

1.3.2 RT-PCR檢測各組細胞TFAM mRNA表達 引物設計：TFAM上游引物5′ GTTGCAACTTCTGTGGAAGCAT 3′，下游引物5′TCCGCCCTATAAGCATCTTGA 3′；β-actin上游引物5′AGGCGAGCATCCCCCAAAG 3′，下游引物5′GGGCACGAAGGCTCATCATT 3′，由TaKaRa Biotechnology有限公司合成?？俁NA的提?。菏褂妹绹鳬nvitrogen公司Trizol試劑，按照試劑說明書中方法對總RNA進行提取。逆轉錄RT反應，按TIANGEN 生物工程公司兩步法反轉錄試劑盒說明書操作。PCR擴增：每個反應體系均為 25 μl，TFAM 反應條件：預變性 95℃，10 min；變性95℃，10 s；退火64℃，20 s；延伸72℃，15 s；進行45個循環(huán)。

1.3.3 流式細胞儀監(jiān)測細胞內活性氧、線粒體膜電位、細胞凋亡率 按照線粒體膜電位試劑盒說明書，JC-10孵育20 min，離心后收集細胞，加入Assay buffer，置于流式細胞儀檢測。按照試劑盒說明書進行FITC、PI雙染色，37℃避光放置30 min，置于流式細胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPASS19.0軟件行t檢驗，單因素方差分析。

2 結 果

2.1 不同濃度Ang Ⅱ作用于HUVECs TFAM蛋白、mRNA的表達水平 不同濃度的Ang Ⅱ(0，10-7，10-6，10-5mol/L)作用于細胞24 h后，各組TFAM蛋白相對表達量為0.94±0.04、0.78±0.09、0.48±0.09、0.40±0.73，實驗組蛋白表達量均較對照組減少，具有一定的濃度依賴性(均P<0.01)；同時，A、B、C、D組TFAM mRNA的相對表達量分別為0.94±0.08、0.78±0.09、0.44±0.07、0、40±0.08，與TFAM蛋白的表達水平相似，B、C、D組TFAM mRNA相對表達量與A組相比明顯減少(均P<0.01)。見圖1。

圖1 不同濃度的Ang Ⅱ作用于HUVECs后TFAM的表達量

2.2 流式細胞術檢測不同濃度的Ang Ⅱ對HUVECS膜電位水平、凋亡率 細胞膜電位檢測：JC-10 在線粒體內形成多聚體，其發(fā)射光為紅色熒光；細胞發(fā)生早期凋亡前，線粒體膜電位即表現(xiàn)下降，JC-10以單體的形式存在于胞質內發(fā)綠色熒光。不同濃度的Ang Ⅱ作用細胞24 h后，A、B、C、D組細胞的線粒體膜電位減低水平為26.98±4.46、41.74±4.24、60.47±4.52、70.16±3.07，實驗組較對照組線粒體膜電位下降增多(P<0.01)。細胞凋亡顯示，不同濃度的Ang Ⅱ作用于細胞后，各組的早期凋亡率及晚期凋亡率分別為4.0%、1.8%，10.8%、2.9%，5.2%、8.2%，1.4%、15%。實驗組早期凋亡多于A組，隨著Ang Ⅱ濃度的增加早期凋亡減少，晚期凋亡增加。

3 討 論

冠狀動脈AS主要表現(xiàn)為炎癥引起血管內皮細胞功能紊亂及泡沫細胞形成的慢性退行性病變〔5〕，內皮細胞的功能失調可直接導致AS的發(fā)生發(fā)展〔6〕。本研究結果顯示，Ang Ⅱ可下調HUVECs TFAM表達量，增加線粒體膜電位的下降率及細胞的凋亡率。

ROS主要在線粒體電子傳遞、氧化磷酸化和三羧酸(TCA)循環(huán)的過程中產(chǎn)生。正常情況下，ROS參與關鍵信號通路調節(jié)細胞適應性反應，包括細胞生長和分化〔7〕，一旦失去平衡，ROS過量積累產(chǎn)生的氧化應激可對內皮細胞線粒體、DNA、蛋白質的空間結構造成損傷〔8〕。研究顯示機體內存在Ang Ⅱ刺激細胞使細胞產(chǎn)生ROS的途徑：過多Ang Ⅱ通過調節(jié)NADPH氧化酶(NOX)的活性增加ROS的產(chǎn)生〔9,10〕；另外研究顯示，刺激產(chǎn)生的ROS可作為信號傳導因子，誘導Rac及P40向細胞膜移動，激活蛋白激酶C，誘導內皮細胞NADPH氧化酶活化，導致線粒體的氧化損傷〔11,12〕。

線粒體的早期損傷主要表現(xiàn)為調節(jié)組成線粒體生物合成的蛋白合成減少，其中作為線粒體轉錄及復制的關鍵激活因子及TFAM在氧化應激中起著重要的作用。TFAM是核基因編碼的一種小分子多肽，可維護線粒體DNA的完整性，從而抑制細胞凋亡〔13〕。正常機體中氧化應激損傷時，TFAM增加的表達量可導致線粒體的含量增加，線粒體膜電位增高及凋亡量減少〔14,15〕。Picca等〔16〕報道顯示細胞受到氧化應激時，細胞內的PKA-CREB(G蛋白耦聯(lián)-cAMP 反應原件結合蛋白)通路激活，上調過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子(PGC-1α)、核呼吸因子(NRF)-1的表達量，進而增加TFAM 的表達量；TFAM 與線粒體DNA的親和力增加，調節(jié)線粒體DNA的拷貝數(shù)，維護線粒體DNA的完整和穩(wěn)定，促進線粒體DNA的損傷修復。然而，氧化應激產(chǎn)物的異常積累會損傷細胞核DNA的功能導致TFAM的表達量降低。本研究顯示Ang Ⅱ下調 TFAM表達量，說明細胞對抗氧化應激過度刺激時細胞發(fā)生不可逆的損傷，導致TFAM表達量減少；也有研究顯示可能與細胞內自身的負反饋相關，細胞受到ROS刺激后，線粒體內TFAM的含量增加導致核內的TFAM與NRF-1結合形成免疫共沉淀，導致NRF-1的表達量降低，細胞質內的TFAM表達量降低〔17〕；同時有研究顯示，細胞質中Lon 的蛋白水解酶可以使磷酸化的TFAM裂解，高濃度的ROS抑制HSP60-70-TFAM復合物形成，從而抑制線粒體的生物合成〔18〕。

目前認為線粒體在細胞的死亡中起關鍵作用，承載著為細胞制造能量的重要功能，其功能受損會導致整個細胞的功能障礙。功能障礙及細胞的完整性遭到破壞的內皮細胞，會使脂質代謝紊亂，形成脂質斑塊，最終形成AS。TFAM在線粒體的生物合成中發(fā)揮重要作用，其含量的變化必然引起線粒體功能改變，線粒體膜電位的變化便是最敏感的指示〔19〕，本研究發(fā)現(xiàn)TFAM表達量減少將直接引起線粒體功能障礙。血管內皮細胞作為血管壁的第一層屏障，其完整性具有重要的作用，在導致細胞凋亡的三條基本途徑和誘導的不同類型的細胞凋亡過程中均出現(xiàn)了MMP表達下降其，往往早于細胞形態(tài)學的改變。Lodha等〔20〕對腎臟細胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ會引起ROS的產(chǎn)生使細胞直接進入凋亡程序，進而發(fā)展為腎小管硬化。本研究也同時發(fā)現(xiàn)了高濃度Ang Ⅱ(10-5mol/L)可直接導致細胞不經(jīng)過早期凋亡直接過渡到晚期凋亡。

近期研究顯示，可通過檢測外周血TFAM mRNA的表達量預測骨關節(jié)疾病，同時外周血TFAM mRNA的表達量與軟骨細胞TFAM的表達量呈正相關〔21〕。冠心病患者內皮細胞功能損傷嚴重，由此可推斷TFAM在體內表達量減少，在進一步的研究中，可以通過與正常人進行對照觀察TFAM在冠心病中的表達量，進一步研究其可否作為早期檢測冠心病的標志因子。另外，研究顯示在治療心力衰竭中，體外將TFAM mRNA引入細胞內治療心力衰竭，可增加細胞線粒體的功能〔19〕。推測在治療AS時可以通過靶向治療改善內皮細胞線粒體功能進而保護內皮細胞和修復內皮細胞的損傷。

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〔2016-08-31修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學基金(81000068)；河北省引進留學人員資助項目(C2015005001)

王瑞鵑(1975-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病研究。

侯維娜(1989-)，女，在讀碩士，主要從事心血管內科研究。

R3

A

1005-9202(2017)05-1059-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.008

1 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院心臟內科