黃春波 張豪杰 楊瑞生 李慶安 王偉豐 靳曉亮 李同寬 霍宇飛 馬燕然 胡金江

(濟(jì)源市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 濟(jì)源 459000)

Notch1信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制

黃春波 張豪杰1楊瑞生 李慶安 王偉豐 靳曉亮 李同寬 霍宇飛 馬燕然 胡金江

(濟(jì)源市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 濟(jì)源 459000)

目的 探討Notch1信號(hào)通路在人腦膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光量(real-time)PCR方法檢測(cè) 50 例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和10例正常腦組織中的 Notch1及其下游靶基因Hes1以及增殖指標(biāo)Ki-67及PCNA的 mRNA 表達(dá)。利用Western印跡檢測(cè)Notch1的活化片段NICD的表達(dá)。結(jié)果 Notch1 mRNA 在人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中均可表達(dá)，但在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著高于正常腦組織(P<0.01)，隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，Notch1及其下游靶基因Hes1的表達(dá)也隨之升高，兩者的變化趨勢(shì)一致。Ki-67在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)升高，與正常腦組織對(duì)比差異顯著(P<0.01)；PCNA在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)同樣升高，與正常腦組織對(duì)比差異顯著(P<0.05)。結(jié)論 Notch1信號(hào)通路可能通過Hes1作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，進(jìn)而參與到腫瘤的形成及惡化。

Notch1信號(hào)通路；人腦膠質(zhì)瘤

腦膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的、預(yù)后很差的原發(fā)性惡性腫瘤，手術(shù)聯(lián)合放、化療的綜合治療后的膠質(zhì)瘤病人極易復(fù)發(fā)，且容易產(chǎn)生對(duì)放化療作用的抵抗。因此尋找更為有效的治療方法至關(guān)重要。Notch1信號(hào)通路在正常組織中，可以參與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)組織的修復(fù)，其受體在正常組織中廣泛分布，可參與胚胎的發(fā)育、組織的生成〔1〕。在膠質(zhì)瘤和髓母細(xì)胞瘤中Notch1信號(hào)通路異常激活。異常激活的Notch1信號(hào)通路促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞分化和血管化，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞惡化并通過促進(jìn)血管化加速腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔2〕。Zhang等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)通路可能參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。臨床流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)Notch1可以作為膠質(zhì)瘤的一個(gè)標(biāo)志物分子〔4〕，在膠質(zhì)瘤篩查中具有一定的作用。但是對(duì)于具體的Notch1信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的具體分子機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過基因及蛋白水平檢測(cè) Notch1及其下游靶基因Hes1，在各級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織的表達(dá)情況，分析其與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的相關(guān)性，探討Notch1在人腦膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集濟(jì)源市人民醫(yī)院2012年2月至2015年9月手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)瘤新鮮標(biāo)本50例，男 29 例，女 21 例，年齡 22～65歲，中位年齡43.5歲 。按2000年WHO腦腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)(低度惡性膠質(zhì)瘤)28 例； Ⅲ～Ⅳ級(jí)(高度惡性膠質(zhì)瘤)22例。所有標(biāo)本均為首次確診，手術(shù)前未經(jīng)任何化療、放療及其他免疫抑制治療。通過內(nèi)減壓手術(shù)獲得新鮮正常腦組織標(biāo)本 10 例作為對(duì)照 。所有標(biāo)本均凍存在-80℃冰箱內(nèi)。主要試劑：Trizol購自美國(guó)Ambion公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen中國(guó)公司； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)中的熒光染料iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix購自美國(guó)BIO-RAD公司；Western印跡檢測(cè)所有蛋白抗體Notch1抗體及β-actin抗體均購自英國(guó)Abcam公司；蛋白二抗購自北京中山金橋公司；Notch1、Hes1級(jí)ki-67擴(kuò)增引物均由Invitrogen公司合成。引物序列：ki-67上游引物：5′-GCACTCTCCGCTCAGTAAGTC-3′，下游引物：5′-GGCCTGATGTTTGGAAGACC-3′;PCNA上游引物：5′-GGCAGAGGGTTGGTAGATGT-3′,下游引物：5′-ACAAACATGGTGGCGGTGTT-3′；Notch1上游引物：5′-TTCGTGCTCCTGTTCTTTGTC-3′,下游引物：5′-GGGCTCTCTCCGCTTCTTG-3′；Hes1：上游引物：5′-CGACACCGGACAAACCAAT-3′，下游引物：5′-GAATGTCTGCCTTCTCCAGCTA-3′;β-actin：上游引物：5′-ATGTGGATCAGCAAGCAGGA-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′。

1.2 方法

1.2.1 real-time PCR檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤中Notch1、Hes1及ki-67基因表達(dá)水平 取-80℃凍存的組織，用TRIzol試劑提取RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用real-time PCR法檢測(cè)Notch1、Hes1及ki-67的mRNA相對(duì)水平變化。

1.2.2 Western印跡檢測(cè)組織中Notch1蛋白表達(dá)水平 取-80℃凍存的組織50 mg，研磨成細(xì)胞勻漿，加入組織裂解液500 μl和多種蛋白酶抑制劑混合液(cocktail)5 μl，冰??；4℃ 12 000 r/min，離心10 min后取上清，采用Bradford法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)的濃度。按照每泳道100 μg加樣進(jìn)行100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)；用含50 g/L脫脂奶粉的PBST(PBS+0.1%Tween-20)溶液封閉2 h后，加入Notch1抗體(1∶2 000)和β-actin(1∶5 000)一抗，4℃過夜；用PBST溶液洗膜3次，10 min/次。然后加入辣根過氧化物酶(HRP)-labeled(1∶20 000)二抗，室溫避光孵育1 h，再用PBST溶液洗膜3次，10 min/次，然后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光底物顯影、定影、拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組Notch1及Hes1 mRNA的表達(dá)水平 膠質(zhì)瘤組中Notch1 mRNA水平(1.89±0.18)、Hes1 mRNA水平(1.44±0.15)均高于正常對(duì)照組(均為1)(均P<0.01)；且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，Notch1及Hes1 mRNA水平也逐漸升高。Hes1的變化水平同Notch1一致。其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)Notch1及Hes1 mRNA為1.68±0.28，1.29±0.16，Ⅲ～Ⅳ級(jí)為2.10±0.39，1.65±0.07。

2.2 兩組ki-67及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的mRNA水平比較 ki-67在膠質(zhì)瘤組中表達(dá)(3.43±0.20)高于正常對(duì)照組(1)(P<0.05)。隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的升高，ki-67的mRNA表達(dá)也逐漸升高(Ⅰ～Ⅱ級(jí)：2.84±0.13，Ⅲ～Ⅳ：4.01±0.91)。PCNA在人腦膠質(zhì)瘤組中表達(dá)(2.19±0.54)高于正常對(duì)照組(1)(P<0.05)，且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而升高(Ⅰ～Ⅱ級(jí)：2.01±0.72，Ⅲ～Ⅳ級(jí)：2.37±0.39)。

2.3 兩組Notch1的蛋白水平比較 Western印跡結(jié)果同real-time PCR結(jié)果一致，膠質(zhì)瘤組Notch1的活化片段NICD水平較正常腦組織組高，隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，NICD的表達(dá)增高。見圖1。

1：正常腦組織2：Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤3：Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤4：Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤5：Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤 圖1 兩組Notch1活化片段NICD的變化水平

3 討 論

膠質(zhì)瘤死亡率較高，在國(guó)內(nèi)顱內(nèi)腫瘤中占44.69%〔5〕。膠質(zhì)瘤主要分為星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤〔6〕。星形細(xì)胞瘤最常見。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級(jí))有最高程度的惡性腫瘤和侵襲能力，占腦腫瘤的50%～60%〔7〕。多種癌基因和抑癌基因異常與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān) 。而腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后均與腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)。有研究顯示Notch1信號(hào)通路可以參與到腫瘤細(xì)胞的增殖，而ki-67及PCNA是一種與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原,是近年來認(rèn)為更能有效評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)志物〔8〕。

Notch1信號(hào)通路的異?？梢詫?dǎo)致機(jī)體功能紊亂，致使腫瘤的發(fā)生；(NICD)是Notch1的活化片斷；在Notch1信號(hào)通路中，當(dāng)配、受體結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象改變時(shí)，暴露出受體胞外域的腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)化酶(TACE)金屬蛋白酶切割位點(diǎn)，在TACE作用下，Notch胞外段發(fā)生切割，切割后游離的N端裂解片段(胞外區(qū))被配體表達(dá)細(xì)胞內(nèi)吞，而保留于受體細(xì)胞胞內(nèi)的C端裂解片段則在γ-secretase的作用下進(jìn)一步剪切，釋放出游離于胞質(zhì)中的Notch1受體活化形式(NICD/ICN),活化的NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，可與轉(zhuǎn)錄抑制因子RBP-JK(也稱為CSL/CBFl)結(jié)合，進(jìn)而與共活化物Co-A(MAML、組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶p300/CBP)結(jié)合后，即成為轉(zhuǎn)錄活化因子，活化Hes1等分化拮抗基因并募集Groucho/TLE等轉(zhuǎn)錄共抑制因子，阻礙細(xì)胞特異性分化效應(yīng)基因的表達(dá)，最終影響細(xì)胞的分化、增殖和凋亡〔9〕。Hes1是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可維持細(xì)胞未分化狀態(tài)，使其保持足夠增殖細(xì)胞數(shù)目，是Notch1的下游靶基因〔10〕。

本研究說明 Notch1的表達(dá)水平與人腦膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別相關(guān)，與人腦膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān) 。這與Yao等〔11〕的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)通路在發(fā)揮作用時(shí)，是通過Hes1來向下傳導(dǎo)的?？傊?，Notch1的表達(dá)及活化程度不僅與人腦膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別相關(guān)，同樣與腫瘤的惡化程度有關(guān)。

膠質(zhì)瘤惡性程度的病理分級(jí)是根據(jù)其血管化、局灶壞死程度和腫瘤細(xì)胞的增殖而決定的〔11〕。ki-67及PCNA不僅是細(xì)胞增殖常用的指標(biāo)，同樣是判斷膠質(zhì)瘤惡性程度及其預(yù)后的指標(biāo)〔12〕。腫瘤增殖活性的檢測(cè)對(duì)于判斷其惡性程度、預(yù)見其生物學(xué)行為以及評(píng)估預(yù)后和選擇適當(dāng)?shù)闹委煷胧┮饬x重大。本研究推測(cè),Notch1信號(hào)通路可能通過Hes1作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，進(jìn)而參與到腫瘤的形成及惡化。以Notch1信號(hào)通路為靶點(diǎn)是臨床研究的新進(jìn)展及重大挑戰(zhàn)。目前主要的干預(yù)有：(1)阻礙Notch受體的激活，包括γ-分泌酶抑制劑(GSIs)。(2)阻礙配體的結(jié)合包括單克隆抗體(mAbs)或者誘導(dǎo)劑(decoy)。(3)阻礙NICD的轉(zhuǎn)錄活性〔13〕。然而，由于Notch1表達(dá)的廣泛性，也為治療策略提出了更高的要求。

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〔2016-07-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.201403318)

黃春波(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科疾病研究。

R651

A

1005-9202(2017)05-1067-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.012

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院