謝 飛 王衛(wèi)星

原發(fā)性肝癌組織MicroRNA-497表達及與患者臨床特征和生存率的關(guān)系

謝 飛 王衛(wèi)星*

目的：回顧性分析microRNA-497(miRNA-497)在原發(fā)性肝癌(HCC)患者癌組織中的表達及與患者臨床特征和生存率的關(guān)系。方法：收集 2010-01—2010-10接受手術(shù)治療的61例HCC患者，采用熒光定量PCR檢測其癌組織及癌旁組織miRNA-497的相對表達量。以癌組織miRNA-497相對表達水平的中位數(shù)為界限，將61例患者分為miRNA-497高表達組(n=21)和miRNA-497低表達組(n=40)。比較癌組織與癌旁組織miRNA-497水平差異；同時分析miRNA-497高表達組與miRNA-497低表達組臨床特征和預(yù)后危險因素；比較兩組平均生存率和累計生存率的差異。結(jié)果：miRNA-497在癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HCC患者癌組織miRNA-497低表達組血清AFP水平、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯與高表達組分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。多因素回歸分析顯示血管侵犯、TNM分期、miRNA-497表達量是影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。Kaplan-Meier分析表明，miRNA-497低表達組平均生存期明顯低于高表達組(19.0個月vs 33.3個月)，1年、3年、5年累計生存率也較miRNA-497高表達組明顯降低(55.0% vs 71.4%、20.0% vs 42.9%、15.0% vs 37.5%，P<0.05)。結(jié)論：miRNA-497在HCC組織中的低表達提示預(yù)后不良。

原發(fā)性肝癌； microRNA-497； 生存率

原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是國人常見惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、發(fā)展快、惡性程度高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高及預(yù)后差等特點[1]。已有研究表明微小RNA(MicroRNA，miRNA)在許多腫瘤中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用[2]，因而受到腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)研究的廣泛關(guān)注。截至目前，miRNA-497與較多惡性腫瘤的關(guān)系已見報道，但其與HCC的關(guān)系，包括在癌組織中的表達量及與患者臨床特征和術(shù)后生存率的關(guān)系所見報道甚少。本研究對此進行了初步探討，結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例分組及資料獲取

本院2010-01-2010-10收住院HCC患者61例，均切除癌組織并經(jīng)病理組織學(xué)檢查(HE染色)診斷為HCC，如圖1。同時取少部分癌組織和癌旁組織保存于-80℃冰箱中待測miRNA-497。以此次61例HCC癌組織miRNA-497相對表達水平的中位數(shù)為界值，將上述患者分為miRNA-497高表達組(21例，miRNA-497≥0.24)和miRNA-497低表達組(40例，miRNA-497<0.24)。

查閱病歷檔案，獲取兩組患者性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、有無乙肝和肝硬化、HCC家族遺傳史、甲胎蛋白(AFP)水平、抗病毒治療情況、腫瘤個數(shù)、大小以及包膜完整性、血管侵犯、Edmondson分級[3]、TNM分期[4]、Chlid-pugh分級[5]等臨床資料。

本實驗經(jīng)由武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，同時取得患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 miRNA-497水平檢測

1.2.1 主要試劑及儀器：Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，7300型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，SYBR?Premix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)。miRNA-497上游引物為5’-ACA CTC CAG CTG GGC AGC AGC ACA CTG TG-3’，下游引物為5’-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACA AAC CA-3’；內(nèi)參U6上游引物為5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物為5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’，均由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取：從-80℃冰箱中取出標(biāo)本，液氮研磨肝癌組織及其癌旁組織，組織勻漿后加入Trizol試劑，按照說明書提取總RNA。采用核酸微量檢測儀檢測總RNA純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.2.3 熒光定量PCR：取A260/A280在1.8-2.0的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系為20μl，按照Takara公司提供的逆轉(zhuǎn)錄說明書操作。具體反應(yīng)條件為：37℃ 30min，95℃ 5s，4℃保存。再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系參照說明書，反應(yīng)條件為：50℃ 2min，95℃ 2min， 60℃

圖1 HCC患者癌組織及癌旁組織病理結(jié)果(HE，×100)

30s，40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)擴增三次，取均值為該樣本的檢測水平。實驗結(jié)果采用2-△△Ct法計算。以U6作為內(nèi)參。有多個腫瘤的患者檢測每個腫塊的miRNA-497相對表達量，計算均值為該患者腫瘤組織中miRNA-497的相對表達量。

1.3 隨訪方法

所有患者術(shù)后第一個月隨訪一次，以后每3個月隨訪一次，2年后每6個月隨訪一次。隨訪方式為電話詢問，截止日期為2015-10，隨訪終點事件為患者死亡。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HCC患者癌組織和癌旁組織miRNA-497表達量

HCC患者癌組織中miRNA-497的相對表達量明顯低于癌旁組織(0.25±0.03 vs 0.99±0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.125，P<0.05)，見圖2。

注：與癌旁組織相比較，*P<0.05

2.2 不同miRNA-497表達量HCC患者一般資料和臨床特征

表1顯示，不同miRNA-497表達量的兩組HCC患者血清AFP水平、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯等指標(biāo)存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，而其它指標(biāo)的組間差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同miRNA-497表達量HCC患者一般資料和臨床特征比較

注：與miRNA-497低表達組相比，1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 HCC患者預(yù)后因素回歸分析

單因素和多因素回歸分析顯示，血管侵犯、TNM分期、miRNA-497表達量是影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素(均P<0.05)，見表2。

微循環(huán)學(xué)雜志2017年第27卷第1期臨床研究 ▲

表2 HCC患者預(yù)后的單因素和多因素分析

2.4 miRNA-497低表達和高表達HCC患者生存率比較

Kaplan-Meier分析表明，miRNA-497低表達組平均生存期明顯低于miRNA-497高表達組(19.0個月vs 33.3個月)，1年、3年、5年累計生存率也明顯低于高表達組(55.00% vs 71.40% 、20.00% vs 42.90% 、15.00% vs 37.50%，均P<0.05)，見圖3。

圖3 miRNA-497低表達組和高表達組HCC患者生存率

3 討 論

miRNA是由19-22個核苷酸分子構(gòu)成的高度保守非編碼的內(nèi)源性單鏈小RNA。通過與特定的mRNA結(jié)合，降解或者抑制其翻譯過程，從而參與早期胚胎和器官發(fā)育、正常細胞增殖與凋亡、細胞分化等生物學(xué)行為。同時，miRNA在人體腫瘤細胞增殖、分化、遷移和凋亡中也起著重要作用[3]，可促進肝細胞癌、乳腺癌、胰腺癌等的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移[4]。

miRNA-497位于人類染色體17p13.1上，其AGCAGC序列起始于成熟體5’末端的第一個或第二個核苷酸，屬于miR-15/107家族中的一員[5]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者癌組織的miRNA-497表達明顯低于癌旁組織[6]。miRNA-497在結(jié)直腸癌中的表達也明顯低于正常結(jié)腸組織，從而使胰島素樣生長因子受體(Insulin-like Growth Factor 1 Receptor，IGF1-R)的表達和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3 Kinase/Protein Kinase B, PI-3K/PKB )信號通路受抑，減少IGF1-R和PKB活化，導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者惡性程度增加[7]，miRNA-497在HCC患者癌組織中也表現(xiàn)為低表達[8]，而且其低表達可能導(dǎo)致細胞周期檢查點激酶1(Cell-cycle-checkpoint kinase 1, CHEK1)高表達，加重HCC患者不良預(yù)后[9]。

本文結(jié)果證實，HCC患者癌組織中miRNA-497表達量明顯低于癌旁組織，表明miRNA-497對HCC的發(fā)生和發(fā)展起到一定的作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)miRNA-497低表達組HCC患者部分臨床特征，如血清AFP水平、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯均與高表達組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。間接說明miRNA-497低表達與HCC患者癌組織增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究通過對胰腺癌組織分析表明，miRNA-497低表達患者累計生存率明顯低于高表達患者，提示臨床可以通過抑制成纖維細胞生長因子2(FGF2)和成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)的表達來調(diào)控胰腺癌的惡性表型和化療敏感度，從而為胰腺癌的靶向治療提供一定的方向[10]。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-497低表達患者術(shù)后1年、3年、5年生存期明顯低于高表達組(55.00%、20.00%、15.00% vs 71.40%、42.90%、37.50%)，平均生存期也明顯低于高表達組(19.0個月 vs. 33.3個月)，也可借鑒以上途徑為HCC治療尋找方向。在目前對于HCC患者miRNA-497低表達及低表達患者生存率低于高表達的具體原因和機制尚不清楚的情況下，加強miRNA-497低表達患者隨訪，密切監(jiān)測患者是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，及時采取治療措施，對延長患者生命具有積極意義。

綜上所述，HCC患者癌組織miRNA-497的表達量分析可以用于評估患者的預(yù)后，也可為HCC的靶向治療提供初步依據(jù)，但本文納入病例較少，有待大樣本驗證，更需加強相關(guān)機制研究。

?

本文第一作者簡介：

謝 飛(1982年-)，男，漢族，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事普外科腫瘤研究

微循環(huán)學(xué)雜志2017年第27卷第1期重癥救治病例 ?

1 El-Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2012, 142(6): 1 264-1 273.

2 Melo SA, Esteller M. A precursor microRNA in a cancer cell nucleus: get me out of here![J]. Cell Cycle, 2011, 10(6): 922-925.

3 Shen J, Stass SA, Jiang F. MicroRNAs as potential biomarkers in human solid tumors[J]. Cancer Lett, 2013, 329(2): 125-136.

4 Di Leva G, Garofalo M, Croce CM. MicroRNAs in cancer[J]. Annu Rev Pathol, 2014, 9(10): 287-314.

5 Finnerty JR, Wang WX, Hebert SS, et al. The miR-15/107 group of microRNA genes: evolutionary biology, cellular functions, and roles in human diseases[J]. J Mol Biol, 2010, 402(3): 491-509.

6 Luo Q, Li X, Gao Y, et al. MiRNA-497 regulates cell growth and invasion by targeting cyclin E1 in breast cancer[J]. Cancer Cell Int, 2013, 13(1): 95.

7 Guo ST, Jiang CC, Wang GP, et al. MicroRNA-497 targets insulin-like growth factor 1 receptor and has a tumour suppressive role in human colorectal cancer[J]. Oncogene, 2013, 32(15): 1 910-1 920.

8 Furuta M, Kozaki K, Tanimoto K, et al. The tumor-suppressive miR-497-195 cluster targets multiple cell-cycle regulators in hepatocellular carcinoma[J]. PLoS One, 2013, 8(3): e60155.

9 Xie Y, Wei RR, Huang GL, et al. Checkpoint kinase 1 is negatively regulated by miR-497 in hepatocellular carcinoma[J]. Med Oncol, 2014, 31(3): 844.

10 Xu J, Wang T, Cao Z, et al. MiR-497 downregulation contributes to the malignancy of pancreatic cancer and associates with a poor prognosis[J]. Oncotarget, 2014, 5(16): 6 983-6 993.

The Expression of MicroRNA-497 in Hepatocellular Carcinoma and its Relationship with Clinical Features and Survival Rate

XIE Fei, WANG Wei-xing*

Department of General Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China；*

Objective: To explore the value of the microRNA-497 expression and clinical significance in hepatocellular carcinoma(HCC).Method: Paired HCC tumor tissues and adjacent non-tumor liver tissues were collected from 61 HCC patients who underwent hepatectomy between January 2010 and October 2010 at our hospital. miRNA-497 was quantified using the RT-PCR. 61 patients were divided into miRNA-497 high expression group (n=21) and miRNA-497 low expression group (n=40), according to the limit of the median expression level of miRNA-497 in tumor tissues. Then, we compared the difference of miRNA-497 levels between cancer tissues and adjacent tissues and analyzed the difference of clinical data and survival rate between miRNA-497 high expression group and miRNA-497 low expression group and found the risk factors of prognosis of patients with HCC.Results: The level of miR-497 was significantly down-regulation compared to paracarcinomatous liver tissues (P<0.05), miR-497 expression was also negatively correlated with serum AFP level, tumor size, TNM stage and venous invasion (allP<0.05). In addition, Kaplan Meier survival analysis showed that the 1-, 3-, and 5-year overall survival rates were lower in the low miR-497 exprssion than the high miR-497 exprssion ( 55.0%, 20.0%, 15.0% vs 71.4%, 42.9%, 37.5%,P<0.05). Multivariable Cox regression analysis revealed that miR-497, TNM stage and venous invasion were independent risk factors for overall survival. Conclusion: miR-497 was down-regulated in HCC and can be served as a novel prognostic marker for HCC.

Hepatocellular carcinoma; MicroRNA-497; Overall survival

武漢大學(xué)人民醫(yī)院普外科，武漢 430060；*

，E-mail:309047@qq.com

本文2016-11-22收到，2017-01-16修回

R735.7

A

1005-1740(2017)01-0047-05