徐玉智，李淑芳，張培君，龔玉梅，王宏俊*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866)

副雞禽桿菌感染對(duì)雞鼻區(qū)免疫相關(guān)因子的影響

徐玉智1，2，李淑芳1，張培君1，龔玉梅1，王宏俊1*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866)

副雞禽桿菌是巴氏桿菌科的一種短小革蘭陰性菌，也是雞傳染性鼻炎的致病菌。為探討副雞禽桿菌感染后靶器官免疫相關(guān)因子的變化情況，用副雞禽桿菌進(jìn)行人工感染SPF試驗(yàn)雞，分別在第3天和第6天采集鼻區(qū)組織，應(yīng)用RT-qPCR方法檢測(cè)了IL-1β、IL-6、 IL-8、 IFN-γ、IL-4、IL-10、 TLR4、TLR5、TLR15、AvβDs 4和AvβDs 10的相對(duì)表達(dá)量；收集鼻黏膜洗液，檢測(cè)sIgA水平。結(jié)果顯示，感染組試驗(yàn)雞IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ、IL-4、IL-10、TLR4、TLR5、TLR15、β-防御素4、10相對(duì)表達(dá)量顯著上升；鼻腔黏膜sIgA顯著增高。提示前炎因子、趨化因子、Th1細(xì)胞因子、Th2細(xì)胞因子都參與了對(duì)副雞禽桿菌感染的免疫調(diào)控，分泌的sIgA在抗副雞禽桿菌感染過程中也起到重要作用。本研究探索了副雞禽桿菌感染后細(xì)胞因子及抗體變化，對(duì)探尋新的免疫或治療方法奠定了基礎(chǔ)。

副雞禽桿菌；細(xì)胞因子；sIgA；黏膜免疫

雞傳染性鼻炎(Infectious coryza,IC)是由副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)引起的一種上呼吸道傳染病。病雞主要表現(xiàn)為顏面水腫，鼻腔有漿液性或黏液分泌物，并伴有結(jié)膜炎和鼻炎[1]。本病一經(jīng)發(fā)生即污染整個(gè)雞場(chǎng)，使幼雞生長(zhǎng)停滯，母雞產(chǎn)蛋量下降(10%～40%)[2]，輕度消瘦和衰弱，肉雞增重下降，因水腫而肉質(zhì)變劣，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。2003年張培君等[3]在北京某雞場(chǎng)分離出B型副雞禽桿菌，龔玉梅等[4]證實(shí)B型分離株具有很強(qiáng)的致病力。該病在我國(guó)大中型養(yǎng)雞場(chǎng)時(shí)有發(fā)生，目前主要采用全菌滅活苗配合抗生素治療的綜合防疫措施來(lái)防治[5]。

雖然滅活菌苗可以給雞提供不同程度的保護(hù)，但存在抗原用量大、副反應(yīng)較強(qiáng)、免疫持續(xù)期較短等不足之處。深入研究雞體對(duì)抗副雞禽桿菌的免疫反應(yīng)，揭示相關(guān)細(xì)胞因子及抗體變化，對(duì)探尋新的免疫治療方法具有一定參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 離心機(jī)5810R/5415D，Eppendorf公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀，Life(USA)公司產(chǎn)品反轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑，Life(USA)公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 PCR試劑，Life(USA)公司產(chǎn)品；RNA提取試劑TRlzol、TMB顯色液，天根生化科技公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgA二抗，Sigma公司產(chǎn)品；RNA later，北京百靈克生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株 6周齡SPF雞購(gòu)自北京梅里亞生物科技公司，在SPF隔離器中飼養(yǎng)至試驗(yàn)結(jié)束；副雞禽桿菌由張培君研究員在北京雞場(chǎng)分離的B型分離株，北京農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所卵黃凍干保存。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物試驗(yàn) B型北京分離株接種到無(wú)菌TSA平皿中，37℃培養(yǎng)18 h。然后，37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)18 h，用無(wú)菌PBS洗下菌株。用梯度稀釋法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，調(diào)至1×106CFU/mL，用于人工感染。

18只SPF雞隨機(jī)分為2組，每組9只，分別屬于人工感染組和對(duì)照組。感染組全部眶下接種副雞禽桿菌(1×106CFU/mL)活菌0.2 mL/只，放入隔離器飼養(yǎng)。對(duì)照組試驗(yàn)雞則眶下注射PBS，0.2 mL/只，放在另一個(gè)隔離器飼養(yǎng)。試驗(yàn)過程中，每只雞作為一個(gè)樣本，進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在第3天和第6天，分別處死人工感染組和對(duì)照組3只雞，采集鼻區(qū)組織，儲(chǔ)存在RNAlater中備用。第6天，每組各處死3只雞，用1 mL黏膜洗液沖洗鼻腔，收集洗脫液，用于sIgA檢測(cè)。

1.2.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 鼻區(qū)組織材料從RNAlater中取出，用無(wú)菌PBS沖洗3遍，放入無(wú)菌研缽中，迅速加入液氮并快速研磨，組織研磨成粉末狀，加入1 mL Trizol裂解液，混合組織與裂解液，轉(zhuǎn)入1.5 mL無(wú)菌EP管中。參照Trizol使用說(shuō)明書分別提取對(duì)照組、免疫組、攻毒組的組織樣品RNA。取5 μL 總RNA，加入DEPC水5.0 μL、隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄引物1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 1μL，在65℃ 5 min，冰浴1 min；加入反轉(zhuǎn)錄體系：5×First-strand buffer 4 μL、0.1 mmol/L dTT 2 μL、RNaseout(40 U/μL)1 μL、SuperScrip Ⅲ RT (200 U/μL) 1 μL，瞬時(shí)離心，25℃ 5 min，50℃ 60 min，70℃ 15 min，立即放置到冰上，制備的cDNA置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，內(nèi)參基因act-b為對(duì)照，用相對(duì)定量的檢測(cè)方法測(cè)定IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ、IL-4、IL-10、TLR4、TLR5、TLR15、β防御素4,10和act-b的Ct值。各因子的特異性引物(表1)通過Primer5設(shè)計(jì)，由北京六合華大科技有限公司合成。人工感染組和空白對(duì)照組每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行重復(fù)。

1.2.4 sIgA的ELISA檢測(cè) 用B型副雞禽桿菌超聲裂解抗原(10 ng/孔)4℃包被過夜，PBST洗3次，用50 g/L脫脂奶37℃封閉2 h，PBST洗3次，用10 g/L脫脂奶1∶1稀釋收集液(人工感染組和對(duì)照組鼻腔洗液)，每孔加入100μL，置于37℃經(jīng)1 h。PBST洗3次，每孔加入羊抗雞IgA酶標(biāo)二抗(1∶10 000)100 μL，37℃經(jīng)1 h。PBST洗3次，TMB顯色15 min，加入終止液50 μL，在450 nm處讀OD值，重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 經(jīng)RT-qPCR反應(yīng)后，獲得目的基因和內(nèi)參基因act-b的Ct值。以act-b為參照，采用2-△△Ct法計(jì)算各基因在不同時(shí)間和不同試驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量。組織樣品的相對(duì)表達(dá)量和ELISA讀數(shù)用Spass制圖和進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 人工感染組Toll-like 受體、β防御素4和10、細(xì)胞因子及趨化因子在鼻區(qū)的表達(dá)

根據(jù)多次研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下，一個(gè)發(fā)病劑量的副雞禽桿菌攻擊后，大部分SPF雞在24 h內(nèi)即可出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。在3 d后雞群臨床癥狀達(dá)到高峰，之后逐漸轉(zhuǎn)歸康復(fù)。6 d～7 d后絕大部分試驗(yàn)雞的臨床癥狀消失。本研究通過RT-qPCR的方法，以actb基因?yàn)閮?nèi)參，比較了2個(gè)時(shí)間點(diǎn)各因子相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，Toll-like受體(TLR4、5、15)在第3天和第6天，相比于對(duì)照組，表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。并且相對(duì)表達(dá)量在第3天高于第6天(圖1)。TLR4是LPS主要受體，LPS是革蘭陰性細(xì)菌外膜的主要成分，TLR5識(shí)別鞭毛蛋白，TLR15是禽類特有的模式識(shí)別系統(tǒng)[6-7]。結(jié)果可知，TLR4、TLR5、TLR15都參與了副雞禽桿菌的識(shí)別。

表1 RT-PCR引物信息表

AvβBD4、AvβBD10在攻毒后第3天和第6天，相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)(圖2)。AvβDs是抗菌肽，在雞天然免疫中起到重要作用[8]。結(jié)果說(shuō)明，AvβBD4、AvβBD10參與了抗副雞禽桿菌的感染過程，驗(yàn)證了天然免疫在抗副雞禽桿菌感染中的作用。

Th2細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)、前炎因子IL-6在第3天和第6天相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。Th1細(xì)胞因子IFN-γ、趨化因子IL-8、前炎因子IL-1β在第3天表達(dá)量顯著增加(P<0.05)(圖3)。在第6天，Th2細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)量仍然顯著，然而,Th1細(xì)胞因子與對(duì)照組相比差異不顯著。結(jié)果說(shuō)明，副雞禽桿菌感染主要引起Th2類型免疫反應(yīng)，前炎因子和趨化因子參與抗副雞禽桿菌的免疫調(diào)節(jié)。

3c、6c是第3、6天的對(duì)照組；3a、6a是第3、6天的人工感染組

3c、6c是第3、6天的對(duì)照組；3a、6a是第3、6天的人工感染組

3c、6c是第3、6天的對(duì)照組；3a、6a是第3、6天的人工感染組

2.2 ELISA檢測(cè)sIgA

雞sIgA主要存在于呼吸道、腸道、膽汁、泌尿生殖道和眼睛中，在保護(hù)黏膜、發(fā)揮局部免疫方面起到重要作用。其不僅可以中和、排斥病原體，防止細(xì)菌、病毒與黏膜結(jié)合，還可以促進(jìn)分泌液中天然抗菌因子的作用，并可調(diào)節(jié)黏膜免疫。在活菌接種后第6天，用ELISA檢測(cè)鼻黏膜sIgA，結(jié)果在攻毒組sIgA水平相對(duì)于對(duì)照組顯著增加(P<0.05)(圖4)。結(jié)果說(shuō)明，sIgA參與了清除副雞禽桿菌感染的過程。

6a是第6天的人工感染組；6c是第6天的對(duì)照組

6a is the 6 days later of the infection group; 6c is the 6 days later of the control group

圖4 感染組sIgA在第6天的相對(duì)值

Fig.4 The relative values of sIgA in the infection group in the sixth day

3 討論

近年來(lái)，隨著超強(qiáng)耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，社會(huì)各界對(duì)抗生素禁用的呼聲愈來(lái)愈高，這促使對(duì)天然免疫和新的免疫預(yù)防方法的深入研究。鼻黏膜是抵抗病原入侵的生理學(xué)和免疫學(xué)屏障。天然免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是清除系統(tǒng)，負(fù)責(zé)抵抗侵入的病原。激活的天然免疫系統(tǒng)的特征是產(chǎn)生炎性因子和抗菌肽。天然免疫細(xì)胞調(diào)控特殊的免疫反應(yīng)，然后引起進(jìn)一步獲得性免疫反應(yīng)。天然免疫和獲得性免疫的復(fù)雜相互作用可能對(duì)于清除副雞禽桿菌感染也十分重要。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是模式識(shí)別系統(tǒng)主要成分。因?yàn)椴≡幸幌盗胁≡嚓P(guān)保守結(jié)構(gòu)(病原相關(guān)分子模式，PAMPs)，所以TLRs不論天然免疫過程中還是獲得免疫過程中都可以檢測(cè)病原入侵，TLRs識(shí)別PAMPs，然后引起快速的、特異的免疫反應(yīng)[7]。在來(lái)亨雞異嗜白細(xì)胞中有TLRs的廣泛表達(dá)[8]。在本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雞鼻區(qū)的TLR4、TLR5、TLR15也都參與了副雞禽桿菌的識(shí)別。

在脊柱動(dòng)物中，鑒定出大量抗菌肽類防御素作為天然免疫成分。雞基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)其含有β防御素家族。禽β防御素(AvβDs)有廣泛的抗微生物作用，可以抗革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌、真菌和酵母，目前發(fā)現(xiàn)的AvβDs一共有14種[9]。TLRs與相應(yīng)配體結(jié)合，可以上調(diào)表達(dá)促炎因子和AvβDs表達(dá)，促炎因子可以進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，也可以繼續(xù)促進(jìn)AvβDs表達(dá)[10-11]。本試驗(yàn)中，雞感染副雞禽桿菌過程中β防御素和促炎因子(IL-1β、IL-6)表達(dá)顯著升高，說(shuō)明天然免疫參與了雞清除副雞禽桿菌的過程。

細(xì)胞免疫和體液免疫分別被Th1/Th2平衡控制,Th1細(xì)胞因子主要調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫對(duì)抗胞內(nèi)細(xì)菌和病毒，Th2細(xì)胞因子抑制一些吞噬細(xì)胞功能，調(diào)控體液免疫，調(diào)控或抑制炎癥，促進(jìn)非吞噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[12-13]。促炎因子和抗炎因子相互作用形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其動(dòng)態(tài)平衡決定了炎癥的發(fā)展與結(jié)局[14]。sIgA是黏膜免疫的主要效應(yīng)分子。有研究資料顯示，細(xì)胞因子在抗沙門菌中起到重要的作用，IFN-γ、IL-12和IL-18表達(dá)與抗沙門菌感染有關(guān)，IL-4和IL-10起到的作用是下調(diào)細(xì)菌的炎癥反應(yīng)[15]。Th1細(xì)胞因子和Th2細(xì)胞因子都參與了雞抗副雞禽桿菌免疫反應(yīng)。IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2類型免疫反應(yīng)關(guān)鍵的細(xì)胞因子[15]。其中IFN-γ可以活化巨噬細(xì)胞，IL-4有拮抗IFN-γ的功能，其可以促進(jìn)Th0細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th2細(xì)胞，減少Th1細(xì)胞的形成，并可以下調(diào)單核巨噬細(xì)胞分泌IFN-γ，分別在細(xì)胞免疫和體液免疫水平抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)可以促進(jìn)B細(xì)胞增殖及分泌IgA、IgE等抗體，促進(jìn)機(jī)體在炎癥消散后產(chǎn)生獲得性免疫。本試驗(yàn)在第6天檢測(cè)到雞鼻黏膜抗副雞禽桿菌sIgA明顯增加。此外，IL-10抑制T細(xì)胞增殖并且可以抑制多種促炎因子的釋放，如IL-1和IL-6[16]。本研究發(fā)現(xiàn)副雞禽桿菌活菌接種有高水平的IL-4和IL-10表達(dá)，可以認(rèn)為獲得性免疫以Th2細(xì)胞反應(yīng)為主。

通過檢測(cè)副雞禽桿菌感染過程中細(xì)胞因子的變化，本研究認(rèn)為，天然免疫和獲得性免疫共同參與了副雞禽桿菌的清除，Th2類型獲得性免疫起到重要作用，最終促進(jìn)了特異性的sIgA分泌。在防治方法的研究過程中，有必要探索更為有效的佐劑或刺激劑，以便更好地激發(fā)產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子。

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Effect ofAvibacteriumparagallinarumInfection on Immune Related Factors in Nasal Region of Chickens

XU Yu-zhi1，2,LI Shu-fang1,ZHANG Pei-jun1,GONG Yu-mei1,WANG Hong-jun1

(1.BeijingInstitutionofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,BAAFS,BeijingMunicipalKeyLaboratoryofAnimalDieasePreventionandControlTechnology,Beijing,100097,China；2.CollegeofBiologicalTechnology,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang，Liaoning，110866,China)

Avibacteriumparagallinarum(Apg) is a Gram negative bacterium of Pasteurellaceae，which is the pathogen of chicken infectious coryza.In order to investigate the changes of immune related factors of the target organ after the infection of Apg,SPF chickens were challenged with Apg.The expressions of IL-1β，IL-6，IL-8，IFN-γ，IL-4，IL-10，TLR4，TLR5，TLR15，AvβDs 4 and 10 were detected by RT-qPCR at three and six days after infection.At the same time,sIgA in nasal region was detected too.The results showed that expressions of IL-1β，IL-6，IL-8，IFN-γ，IL-4，IL-10，TLR4，TLR5，TLR15，AvβDs 4 and AvβDs 10 in infected group increased compared with that in control group,sIgA also increased.It showed that all the proinflammatory factors，chemokines，Th1 cytokines，Th2 cytokines and sIgA were involved in the immune regulation of anti-Apg infection.The changes of cytokines and antibody levels is revealed in this study.It provided a theoretical basis for the development of new immune or treatment methods of Apg.

Avibacteriumparagallinarum; cytokine; sIgA; mucosal immunity

2016-06-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272558)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(xiàng)(201303044)；北京市農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目(KJCX20140410)

徐玉智(1990-)，男，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.612；S858.31

A

1007-5038(2017)01-0036-05