施開創(chuàng)，許心婷，尹彥文，龍飛翔，屈素潔，陳漢忠*

(1.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

2014年-2016年廣西地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2和ORF5基因的遺傳多樣性分析

施開創(chuàng)1，許心婷2，尹彥文1，龍飛翔2，屈素潔1，陳漢忠2*

(1.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

為了解廣西地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)流行毒株的遺傳進(jìn)化情況，對(duì)2014年-2016年來自廣西各地的部分PRRSV陽(yáng)性病料進(jìn)行Nsp2和ORF5基因的擴(kuò)增和測(cè)序分析。結(jié)果獲得34個(gè)Nsp2基因序列和45個(gè)ORF5基因序列，均屬于美洲型毒株。Nsp2基因間核苷酸序列的同源性為91.8%～100%，與PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分別為81.3%～84.3%、88.9%～92.1%、94.3%～99.3%和73.5%～75.1%，而與PRRSV歐洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性為51.5%～53.2%。ORF5基因間核苷酸序列的同源性為82.8%～100%，與PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分別為83.7%～99.5%、85%～95%、83.8%～99.7%和83.2%～86.4%，而與PRRSV歐洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性為62.4%～64.5%。基于Nsp2和ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹中，廣西地區(qū)的毒株主要分布在以JXA1為代表的Ⅳ亞群。表明當(dāng)前廣西PRRSV流行毒株以JXA1株為代表的高致病性美洲型毒株為主，各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差異，尚未發(fā)現(xiàn)歐洲型毒株和美洲型NADC30類毒株。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；Nsp2基因；ORF5基因；遺傳多樣性

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)臨床上的主要特征是妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)弱仔、死胎及木乃伊胎等繁殖障礙，以及各種年齡豬特別是仔豬的嚴(yán)重呼吸道疾病。該病1987年首次在美國(guó)報(bào)道，其病原PRRSV于1991年在荷蘭首次分離到。PRRSV分為以Lelystad virus(LV)株為代表的歐洲型(基因Ⅰ型)毒株和以VR-2332株為代表的美洲型(基因Ⅱ型)毒株，兩者之間核苷酸序列的同源性僅為60% 左右。我國(guó)1996年首次分離到PRRSV美洲型經(jīng)典毒株(Classical PRRSV,C-PRRSV)；2006年分離到以Nsp2蛋白第481位和533-561位氨基酸(共30個(gè)aa)發(fā)生不連續(xù)缺失為遺傳標(biāo)志的PRRSV美洲型高致病性變異毒株(Highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)[1]。PRRSV的Nsp2基因編碼病毒復(fù)制酶，與病毒復(fù)制密切相關(guān)[2]；Nsp2蛋白含有T細(xì)胞表位的潛在區(qū)域，并且富含B細(xì)胞表位，在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮重要作用[3]；Nsp2基因經(jīng)常發(fā)生突變、缺失或插入等遺傳變異，在PRRSV所有基因中變異率最高[4]。ORF5基因編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和非中和抗體[5]；由于受到免疫選擇壓力，ORF5基因亦經(jīng)常發(fā)生變異，是編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因中變異率最高的基因[6]。因此，Nsp2和ORF5成為開展PRRSV遺傳進(jìn)化及分子流行病學(xué)研究的重要靶基因。PRRSV流行毒株不斷發(fā)生變異，出現(xiàn)了不同遺傳特點(diǎn)的新毒株。2008年，美國(guó)學(xué)者分離到NADC30株，發(fā)現(xiàn)其Nsp2基因存在新的變異，在不同區(qū)域出現(xiàn)393個(gè)核苷酸的缺失[7]；我國(guó)也在發(fā)病豬群中分離到Nsp2基因存在393個(gè)核苷酸缺失的NADC30類毒株[8]。此外，歐洲型毒株已在我國(guó)部分省份被發(fā)現(xiàn)[9]，成為養(yǎng)豬業(yè)不容忽視的新威脅。本研究應(yīng)用RT-PCR對(duì)2014年-2016年采集的臨床可疑樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)部分PRRSV陽(yáng)性樣品進(jìn)行Nsp2和ORF5基因的擴(kuò)增和測(cè)序分析，以掌握近年來PRRSV在廣西地區(qū)流行的新特點(diǎn)，為有效防控PRRS提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病料 病料來自2014年-2016年廣西不同地區(qū)送檢的臨床上疑似PRRS病死豬病料，共383份。取肺、淋巴結(jié)和脾等病料組織，置于加有適量PBS(pH 7.2)的滅菌EP管中，放入無菌組織搗碎機(jī)，將組織搗碎，反復(fù)凍融3次，離心后，取上清提取總RNA。

1.1.2 主要試劑 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、TaKaRa LA PCR Kit Ver.2.1試劑盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR MasterMix試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI GenBank上公布的PRRSV代表毒株VR-2332(AY150564)、JXA1(EF112445)、LV(M96262)等基因序列，設(shè)計(jì)PRRSV 通用檢測(cè)引物N-F/N-R、Nsp2基因擴(kuò)增引物Nsp2-1F/Nsp2-1R和Nsp2-2F/Nsp2-2R、ORF5基因擴(kuò)增引物ORF5-F/ORF5-R(表1)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 PRRSV基因擴(kuò)增引物

1.2.2 臨床病料的檢測(cè) 取病料上清，按RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，利用隨機(jī)引物6聚體和Prime Script Ⅱ RTase反轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以此為模板，利用引物對(duì)N-F/N-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)PRRSV。25 μL反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(25 pmol/μL)各0.5 μL，模板cDNA 5 μL，滅菌雙蒸水6.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后分析結(jié)果。

1.2.3 Nsp2及ORF5基因的擴(kuò)增及測(cè)序 隨機(jī)選取經(jīng)引物對(duì)N-F/N-R進(jìn)行PCR檢測(cè)為PRRSV陽(yáng)性的部分樣品，以其cDNA為模板，分別利用引物對(duì)Nsp2-1F/Nsp2-1R、Nsp2-2F/Nsp2-2R、ORF5-F/ORF5-R進(jìn)行PCR，擴(kuò)增Nsp2和ORF5基因序列。50 μL反應(yīng)體系：TaKaRa LATaq酶(2.5 U/μL)0.5 μL，10×LA PCR buffer Ⅱ (Mg2+plus) 5 μL，dNTP Mixture(each 400 μmol/L)8 μL，上、下游引物(25 pmol/μL) 各1 μL，cDNA 8 μL，滅菌雙蒸水26.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 3 min；94℃ 45 s，56℃/59℃30 s，72℃ 120 s， 35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。用膠回收試劑盒回收Nsp2-1、Nsp2-2和ORF5擴(kuò)增片段，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板后選取陽(yáng)性克隆，増菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)鑒定正確后，送上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列比對(duì)分析 應(yīng)用DNA Star軟件包對(duì)Nsp2-1和Nsp2-2片段序列進(jìn)行拼接，獲得完整的Nsp2基因序列。對(duì)ORF5片段進(jìn)行剪切，獲得ORF5基因序列。用生物學(xué)軟件將本研究所得的Nsp2和ORF5基因序列，以及表2中的部分國(guó)內(nèi)外代表毒株的Nsp2和ORF5基因序列進(jìn)行同源性分析和序列比對(duì)，并用MEGA5.1軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 臨床病料RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

引物對(duì)N-F/N-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增ORF7基因片段，結(jié)果表明，2014年-2016年廣西各地采集的383份組織病料中，PRRSV陽(yáng)性167份，陽(yáng)性率為43.6%(圖1)。

2.2 Nsp2和ORF5基因序列測(cè)定

以PRRSV陽(yáng)性病料的cDNA為模板，應(yīng)用引物對(duì)Nsp2-1F/Nsp2-1R、Nsp2-2F/Nsp2-2R、ORF5-F/ORF5-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Nsp2-1目的片段的大小為1 667 bp，Nsp2-2目的片段的大小為1 649 bp(圖2)，ORF5目的片段的大小為1 627 bp(圖3)。對(duì)Nsp2-1和Nsp2-2序列進(jìn)行拼接，獲得完整的Nsp2基因序列多數(shù)為2 850 bp，少數(shù)存在差異；對(duì)ORF5序列進(jìn)行剪切，獲得的ORF5基因序列均為603 bp。共獲得34個(gè)Nsp2基因序列和45個(gè)ORF5基因序列，均已上傳NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，Nsp2基因序列號(hào)為KX077675～KX077708，ORF5基因序列號(hào)為KX077651～ KX077662、KU898905～ KU898937。

表2 PRRSV參考毒株

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3～11.臨床樣品

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.Nsp2-1片段；2.Nsp2-2片段

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Nsp2-1 fragment; 2.Nsp2-2 fragment

圖2 PRRSV陽(yáng)性樣品RT-PCR擴(kuò)增Nsp2基因結(jié)果

Fig.2 RT-PCR results of Nsp2 gene from PRRSV positive samples

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.ORF5片段

M.DNA Marker DL 2 000; 1.ORF5 fragment

圖3 PRRSV陽(yáng)性樣品RT-PCR擴(kuò)增ORF5基因結(jié)果

Fig.3 RT-PCR results of ORF5 gene from PRRSV positive samples

2.3 Nsp2基因序列分析

2.3.1 同源性分析 本研究所得34個(gè)Nsp2基因核苷酸序列的同源性為91.8%～100%，推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為87.7%～100%。它們與美洲型代表株VR-2332、中國(guó)經(jīng)典毒株CH-1a、HP-PRRSV代表株JXA1、美國(guó)變異株NADC30核苷酸序列的同源性分別為81.3%～84.3%、88.9%～92.1%、94.3%～99.3%和73.5%～75.1%，與相應(yīng)毒株氨基酸序列的同源性分別為75.1%～79.6%、83.5%～88.5%、91%～98.6%和66.3%～71.2%；而與歐洲型代表株LV核苷酸序列的同源性為51.5%～53.2%，氨基酸序列的同源性為29%～33.3%。結(jié)果表明，所得PRRSV分離株均為美洲型毒株，各毒株的Nsp2基因序列存在一定的差異。

2.3.2 氨基酸序列比對(duì) 對(duì)所得Nsp2基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，主要變異位點(diǎn)見表3。所得34個(gè)毒株均在Nsp2蛋白的第481位和第533-561位出現(xiàn)30個(gè)aa的不連續(xù)缺失，屬于HP-PRRSV。此外，與VR-2332株比較，GXLZ31-2015還在第38位出現(xiàn)1個(gè)aa缺失；GXNN01-2016和GXNN02-2016在第494-512位出現(xiàn)連續(xù)19個(gè)aa缺失；GXNN01-2014、GXNN01-2015、GXNN02-2015、GXNN04-2014、GXNN04-2015、GXNN05-2015和GXQZ01-2014在第628-747位出現(xiàn)120個(gè)連續(xù)的aa缺失，與TJM-F92疫苗株的缺失一致，僅有830個(gè)aa；其余24個(gè)毒株的Nsp2蛋白未出現(xiàn)缺失，共950個(gè)aa；未發(fā)現(xiàn)與NADC30株類似的缺失。已知Nsp2蛋白的3個(gè)毒力相關(guān)位點(diǎn)分別位于第285(S)、568(D)和569(E)位aa，本研究所得34個(gè)毒株的Nsp2蛋白，GXNN11-2015由E569→K569，GXNN13-2015由E569→A569，其余毒株在上述位點(diǎn)均未發(fā)生突變。

表3 各分離株Nsp2蛋白氨基酸缺失位點(diǎn)

注：“+”表示該位點(diǎn)存在氨基酸缺失；“-”表示該位點(diǎn)不存在氨基酸缺失。

Note:“+” stands for the deletion of amino acid in the sites; “-” stands for the non-deletion of amino acid in the sites.

2.3.3 遺傳進(jìn)化樹分析 利用MEGA5.1軟件，基于Nsp2基因推導(dǎo)的氨基酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹。如圖4所示，國(guó)內(nèi)外美洲型PRRSV毒株可分為4個(gè)亞群：以NADC30株為代表的Ⅰ亞群(圖中標(biāo)注“●”部分)，以VR-2332株為代表的Ⅱ亞群(圖中標(biāo)注“■”部分)，以CH-1a株為代表的Ⅲ亞群(圖中標(biāo)注“▼”部分)，以JXA1株為代表的Ⅳ亞群(圖中標(biāo)注“◆”部分)，而來自廣西各地的34個(gè)毒株中有3株屬于Ⅲ亞群、31株屬于Ⅳ亞群。結(jié)果表明，2014年-2016年廣西PRRSV流行毒株以高致病性變異株JXA1為代表的Ⅳ亞群為主。

2.4 ORF5基因的序列分析

2.4.1 同源性分析 本研究所得45個(gè)ORF5基因間核苷酸序列的同源性為82.8%～100%，推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為81.5%～100%。它們與美洲型代表株VR-2332、中國(guó)經(jīng)典毒株CH-1a、HP-PRRSV代表株JXA1、美國(guó)變異株NADC30核苷酸序列的同源性分別為83.7%～99.5%、85%～95%、83.8%～99.7%和83.2%～86.4%，與相應(yīng)毒株氨基酸序列的同源性分別為82.0%～99%、84.5%～92.5%、83%～99%和83.5%～86.6%；與歐洲型代表株LV核苷酸序列的同源性為62.4%～64.5%，氨基酸序列的同源性為53.5%～58.4%。結(jié)果表明，2014年-2016年廣西PRRSV分離株均為美洲型毒株，各毒株ORF5基因序列間存在不同程度的變異。

2.4.2 氨基酸序列比對(duì) 對(duì)所得ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，主要變異位點(diǎn)見表4。GP5氨基酸序列中第13位和第151位是PRRSV潛在毒力相關(guān)的位點(diǎn)，強(qiáng)毒株為R13、R151，弱毒株為Q13、G151。本研究所得的45個(gè)ORF5基因序列中，GX01-2015、GX02-2015發(fā)生R13→Q13，GXNN08-2015發(fā)生R13→Y13；GXLB01-2015、GXBY01-2015等20個(gè)毒株發(fā)生R151→K151；GXLB01-2014發(fā)生R13→Q13、R151→T151。在決定病毒準(zhǔn)種的第137位氨基酸上，疫苗株為A137，野毒株則為S137，本研究中除了GXLB04-2014為A137外，其余均為S137。

圖4 基于Nsp2基因推導(dǎo)的氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹

亞群Subgroup毒株Strains毒株數(shù)Strainnumber野毒相關(guān)表位Wild?typerelatedepitope13151137B細(xì)胞中和表位BcellNE39B細(xì)胞非中和表位BcellNon?NE2729185189T細(xì)胞表位Tcellepitope121127161ⅡVR?2332RRALVAVITFI其他Others1QTⅠNADC30QKSAVAVIL其他Others2QSSAVAVIL1YKSPVAVIL1KSSAVAVILⅢCH?1aSFVLILV其他Others3SMALILVⅣJXA1SIVALILV其他Others20SIVALILV17KSIVAVILV

注：以VR-2332為參考毒株，留空部分表示氨基酸未發(fā)生變異。

Note:Compared with VR-2332,aa sites that do not mutate are in blank.

目前,已知GP5存在3個(gè)B細(xì)胞表位和2個(gè)T細(xì)胞表位。B細(xì)胞表位中，第1個(gè)表位(27-30 aa)是非中和表位(non-neutralizing epitope,Non-NE)，該表位在免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，稱誘騙表位。本研究所獲得的45個(gè)毒株，在第27位GX01-2015、GX02-2015、GXNN02-2014發(fā)生V27→A27突變；在第29位除了GXLB01-2014、GXBS05-2015、GXBS20-2015和GXBS54-2015外，其余毒株發(fā)生A29→V29突變。第2個(gè)B細(xì)胞表位(37-45 aa)是GP5的主要中和表位(neutralizing epitope,NE)，其中GXLB01-2014未發(fā)生突變；GX01-2015、GX02-2015和GXNN02-2014發(fā)生L39→S39突變，GXBS05-2015、GXBS20-2015和GXBS54-2015發(fā)生L39→M39突變，GXNN08-2015發(fā)生L39→P39突變，其余毒株均發(fā)生L39→I39突變。第3個(gè)B細(xì)胞表位(180-197 aa)也是非中和表位(Non-NE)，在第185位除GXLB01-2014外，其余均發(fā)生V185→A185突變；在第189位有23個(gè)毒株發(fā)生I189→L189突變，有21個(gè)毒株發(fā)生I189→V189突變,GXLB01-2014在此位點(diǎn)未發(fā)生突變。而T細(xì)胞表位中，在第1個(gè)表位(117-131 aa)除GXLB01-2014未發(fā)生突變，其余毒株均發(fā)生T121→I121、 F127→L127突變。在第2個(gè)T細(xì)胞表位(149-163 aa)，GX01-2015、GX02-2015、GXLB01-2014、GXNN02-2014和GXNN08-2015未發(fā)生突變，其余毒株均發(fā)生I161→V161突變。

2.4.3 遺傳進(jìn)化樹分析 利用MEGA5.1軟件，基于ORF5基因氨基酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹(圖5)。國(guó)內(nèi)外美洲型PRRSV毒株可以分為4個(gè)亞群：以NADC30株為代表的Ⅰ亞群(圖中標(biāo)注“●”部分)，以VR-2332株為代表的Ⅱ亞群(圖中標(biāo)注“■”部分)，以CH-1a株為代表的Ⅲ亞群(圖中標(biāo)注“▼”部分)，以JXA1株為代表的Ⅳ亞群(圖中標(biāo)注“◆”部分)，來自廣西各地的45個(gè)毒株中有4個(gè)位于Ⅰ亞群，1個(gè)位于Ⅱ亞群，3個(gè)位于Ⅲ亞群，其余37個(gè)屬于Ⅳ亞群。結(jié)果表明，廣西地區(qū)2014年-2016年P(guān)RRSV流行毒株以JXA1為代表的Ⅳ亞群為主。

圖5 基于ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

我國(guó)PRRSV流行毒株出現(xiàn)新的特點(diǎn)，除了原有以Ch-1a株為代表的美洲型經(jīng)典毒株(C-PRRSV)和JXA1株為代表的美洲型高致病性變異毒株(HP-PRRSV)外，還在部分省份的臨床發(fā)病豬群中分離到歐洲型毒株[9]，近年又報(bào)道了美洲型NADC30類病毒的存在[8]，使得PRRSV流行毒株日益多樣性，所致疫情日益復(fù)雜，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成更大的威脅。為掌握廣西PRRSV的流行動(dòng)態(tài)，以便及時(shí)、有效地提出防控對(duì)策，我們開展了PRRSV的分子流行病學(xué)研究，并著重對(duì)Nsp2基因和ORF5基因進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，對(duì)國(guó)內(nèi)外代表毒株基于Nsp2和ORF5基因推導(dǎo)氨基酸序列繪制進(jìn)化樹所得的4個(gè)亞群中，2014年-2016年廣西PRRSV流行毒株是以JXA1株為代表的Ⅳ亞群HP-PRRSV為主，未檢測(cè)到歐洲型毒株和美洲型NADC30類毒株，也未檢測(cè)到美洲型經(jīng)典毒株。因此，在高度警惕歐洲型毒株和美洲型NADC30類毒株傳入的同時(shí)，HP-PRRSV仍是當(dāng)前廣西優(yōu)先重點(diǎn)防控的對(duì)象。

Nsp2基因編碼的蛋白在病毒復(fù)制和宿主免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，同時(shí)Nsp2基因是PRRSV基因組中發(fā)生變異最高的區(qū)域，并具有很高的耐缺失或插入的能力[10-11]。由ORF5基因編碼的GP5蛋白具有重要的中和表位，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在免疫選擇壓力下，ORF5是編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因中變異率最高的[6]。因此，經(jīng)常選擇Nsp2和ORF5基因開展PRRSV分子流行病學(xué)和遺傳進(jìn)化研究。本研究所得34個(gè)Nsp2基因間的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為91.8%～100%和87.7%～100%，45個(gè)ORF5基因間的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為82.8%～100%和81.5%～100%，各基因序列間的同源性很高，但也存在一定的差異。序列比對(duì)表明，34個(gè)毒株的Nsp2基因中有1株在第38位出現(xiàn)1個(gè)aa缺失，有2株在第494-512位出現(xiàn)連續(xù)19個(gè)aa缺失；有2個(gè)毒株在毒力相關(guān)位點(diǎn)發(fā)生突變，1個(gè)毒株由E569→K569，1個(gè)毒株由E569→A569。GP5蛋白在毒力相關(guān)位點(diǎn)、B細(xì)胞表位、T細(xì)胞表位均發(fā)生突變。在毒力相關(guān)位點(diǎn)第13位和第151位aa出現(xiàn)了以下突變：R13→Q13、R13→Y13；R151→T151、R151→K151。GP5 蛋白誘騙表位(27～30 aa)中大部分突變表現(xiàn)為A29→V29，少數(shù)突變表現(xiàn)為V27→A27。中和表位(37-45 aa)上第39位aa普遍發(fā)生L39→I39突變，個(gè)別毒株發(fā)生L39→S39、L39→M39突變。Nsp2、ORF5基因的缺失、插入、突變及重組等導(dǎo)致病毒基因發(fā)生變異，有可能影響病毒的致病能力和致病特點(diǎn)，還可能改變和促進(jìn)病毒逃避機(jī)體免疫的能力從而影響疫苗的免疫效果，這可能是當(dāng)前臨床上PRRSV流行毒株毒力不斷變化以及疫苗防控效果不佳的重要原因。

病毒基因通過缺失、插入、突變等發(fā)生變異，PRRSV基因可以承受較大基因片段的缺失和插入，如Nsp2可以承受高達(dá)連續(xù)100 aa～200 aa的缺失而不影響病毒的復(fù)制和毒力[12]、從發(fā)病豬群中分離到在Nsp2基因存在自然插入氨基酸的野毒株[10]。此外，病毒基因的重組也是病毒基因發(fā)生變異的重要機(jī)制。由于國(guó)內(nèi)流行毒株很復(fù)雜，存在多樣性，加上各個(gè)豬場(chǎng)普遍使用疫苗，使得同一豬場(chǎng)甚至同一豬群內(nèi)存在不同的野毒株或疫苗株，有可能發(fā)生野毒株與野毒株之間、野毒株與疫苗株之間、疫苗株與疫苗株之間的重組，不斷產(chǎn)生新的強(qiáng)毒株[13-14]。還有，疫苗免疫豬群內(nèi)的強(qiáng)毒株，其變異速率顯著高于非免疫豬群內(nèi)的強(qiáng)毒株的變異速率[15]，導(dǎo)致在使用疫苗免疫來保護(hù)豬群的同時(shí)，也加快了豬群內(nèi)流行毒株的變異速度。由于以上各種因素的共同作用，使得PRRSV流行毒株持續(xù)發(fā)生變異，不斷出現(xiàn)新的流行變異株，給臨床上PRRS的有效防控帶來越來越大的困難。因此，必須加強(qiáng)臨床監(jiān)測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查，及時(shí)掌握PRRSV流行毒株及其遺傳進(jìn)化的新趨勢(shì)、新特點(diǎn)，以便采取有針對(duì)性的措施，有效防控PRRS。

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Genetic Diversity of Nsp2 and ORF5 Genes of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Isolates in Guangxi from 2014 to 2016

SHI Kai-chuang1,XU Xin-ting2,YIN Yan-wen1,LONG Fei-xiang2,QU Su-jie1,CHEN Han-zhong2

(1.GuangxiCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Nanning,Guangxi,530001,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530005,China)

To better understand the genetic diversity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in Guangxi province,the Nsp2 and ORF5 genes were amplified from clinical samples in Guangxi from 2014 to 2016 and the gene sequences were analyzed.The results showed that all the acquired 34 Nsp2 and 45 ORF5 gene sequences belonged to North American genotype PRRSV (NA-PRRSV).Sequence analysis revealed that the homology of the nucleotide of Nsp2 genes was 91.8%-100%,and they shared 81.3%-84.3%,88.9%-92.1%,94.3%-99.3%,73.5%-75.1% identities with NA-PRRSV strain VR-2332,Ch-1a,JXA1 and NADC30,respectively; but shared only 51.5%-53.2% identity with European genotype PRRSV (EU-PRRSV) strain LV.The homology of the nucleotide of ORF5 genes was 91.8%-100%,and they shared 83.7%-99.5%,85%-95%,83.8%-99.7%,83.2%-86.4% identities with NA-PRRSV strain VR-2332,Ch-1a,JXA1 and NADC30,respectively; but shared only 62.4%-64.5% identity with EU-PRRSV strain LV.The phylogenetic analysis showed that all PRRSV isolates were divided into four subgroups based on the deduced amino acid sequences of Nsp2 and ORF5 genes,and most isolates from Guangxi belonged to subgroup IV which was represented by JXA1 strain.The results indicated that the highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) represented by JXA1 strain has become the dominant strain in Guangxi,and there exists genetic diversity among Nsp2 and ORF5 genes of isolated strains,while EU-PRRSV and NADC30-like strain of NA-PRRSV have not yet been found.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; Nsp2 gene; ORF5 gene; genetic diversity

2016-05-29

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科轉(zhuǎn)14125004-22)

施開創(chuàng)(1968-)，男，廣西南寧人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物疫病診斷與防控技術(shù)研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)01-0028-08