蔡樹東，成大榮，朱善元，吳 雙*，左偉勇

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300)

研究論文

大腸埃希菌ETT2毒力島ECs3703基因和HPI毒力島irp2基因雙重LAMP檢測方法的建立

蔡樹東1，成大榮1，朱善元2，吳 雙2*，左偉勇2

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300)

根據(jù)GenBank中大腸埃希菌ETT2毒力島保守基因ECs3703和HPI毒力島的保守基因irp2分別設(shè)計一套LAMP引物，在同一體系中進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，通過對體系Mg2+、dNTP、內(nèi)引物及反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等進(jìn)行優(yōu)化，建立了在60℃恒溫下對大腸埃希菌ETT2和HPI毒力島進(jìn)行同步檢測的LAMP方法，并進(jìn)行了特異性和靈敏性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，所建立的雙重LAMP檢測方法同時檢測ETT2和HPI毒力島大腸埃希菌檢測限均可達(dá)到100 fg，比常規(guī)PCR靈敏度高100倍。利用該方法對8株非大腸埃希菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。用該方法對采集的20份臨床樣品進(jìn)行檢測，與雙重PCR檢測結(jié)果一致。結(jié)果顯示，該雙重LAMP方法可用于大腸埃希菌ETT2和HPI毒力島的同步快速檢測，可作為臨床疫病診斷的有效手段。

大腸埃希菌；ETT2毒力島；HPI毒力島；雙重LAMP

大腸埃希菌(Escherichiacoli)是人和動物腸道中普遍存在的一類細(xì)菌。根據(jù)其致病性大致分為腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、產(chǎn)毒素性大腸埃希菌(ETEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHEC/STEC)和黏附性大腸埃希菌(EAEC)[1]。由大腸埃希菌引起的疾病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了不可估量的損失，近年來新發(fā)現(xiàn)的各種毒力島使得大腸埃希菌的致病性更具復(fù)雜性，主要有ETT2毒力島和HPI毒力島等。

ETT2毒力島全稱為大腸埃希菌3型分泌系統(tǒng)2(E.colitype three secretion system 2，ETT2)毒力島，大小約29.9 kb。德國學(xué)者Prager R等對豬源大腸埃希菌ETT2毒力島進(jìn)行了檢測和序列分析，初步揭示了ETT2毒力島的遺傳與進(jìn)化，并揭示可能與豬源大腸埃希菌的致病性密切相關(guān)。HPI毒力島全稱為耶爾森菌強(qiáng)毒力島(high pathogenicity island，HPI)，大小約為35 kb，最早發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌屬，與小鼠致死表型密切相關(guān)，被命名為強(qiáng)毒力島。Schubert S首次報道在人源致瀉性大腸埃希菌中，除腸出血性大腸埃希菌外，均不同程度地攜帶耶爾森菌HPI毒力島相關(guān)基因，其中ETEC中有93%，EIEC中有27%，EPEC和ETEC中發(fā)現(xiàn)有5%的HPI的存在，且其irp2和fyuA基因與耶爾森菌幾乎相同，這提示了HPI毒力島可在鼠疫耶爾森菌和致病性大腸埃希菌之間水平傳播[2]。因此，建立一種快速、高效、簡便的檢測方法是大腸埃希菌臨床檢測的迫切需要。目前用于大腸埃希菌的檢測方法有傳統(tǒng)方法和基因方法。傳統(tǒng)的檢測方法費(fèi)時費(fèi)力，操作復(fù)雜，已不能滿足基層和臨床中及時、靈敏、快速檢測的要求，不利于疾病的防控；基因檢測技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，已成為病原檢測的重要技術(shù)之一，主要包括常規(guī)PCR、套式PCR和實(shí)時熒光定量PCR等，但該技術(shù)需要依靠昂貴的PCR儀器設(shè)備，不利于基層推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(cloop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是由Notomi T等[3]于2000年研發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、擴(kuò)增效率高而且產(chǎn)物檢測簡便，目前已廣泛應(yīng)用于病原體檢測、動物胚胎性別鑒定、轉(zhuǎn)基因食品檢測及腫瘤基因檢測等領(lǐng)域。近年來，不少學(xué)者利用該技術(shù)的多重檢測方法進(jìn)行同種病原多種基因的快速檢測和多種不同病原的初篩快速檢測。本研究選擇大腸埃希菌ETT2毒力島ECs3703基因和HPI毒力島irp2基因序列為保守基因，分別設(shè)計LAMP引物，建立了大腸埃希菌2種毒力島的雙重LAMP檢測方法，希望能有效提高大腸埃希菌檢測效率，節(jié)約檢測成本，為基層和現(xiàn)場病原檢測提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 ETT2毒力島大腸埃希菌、HPI毒力島大腸埃希菌、葡萄球菌、巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、鴨疫里默菌、變形桿菌、鏈球菌、沙門菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存。1.1.2 主要試劑與儀器 dNTP Mixture和DNA Marker DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；MgCl2和Bst DNA 聚合酶，New England Biolabs公司產(chǎn)品；SYBR Green I，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀，LAMP擴(kuò)增儀，水浴鍋，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 以ECs3703基因作為ETT2毒力島的檢測標(biāo)志基因，irp2基因作為HPI毒力島的檢測標(biāo)志基因。下載GenBank中發(fā)表的ECs3703序列和irp2序列，用MegAlign軟件分別對兩種基因組序列進(jìn)行對比分析，分別選擇各自的保守序列，運(yùn)用引物在線設(shè)計軟件PrimerExplorer V4進(jìn)行引物設(shè)計，并根據(jù)引物設(shè)計原則進(jìn)行篩選。引物序列見表1。

表1 雙重LAMP中所用到的引物

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的制備 將細(xì)菌分別接種于TSB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6 h～8 h，取1 mL細(xì)菌培養(yǎng)物于1.5 mL指形管中，在4℃以12 000 r/min離心5 min，棄去上清。將沉淀重懸于100 μL滅菌的超純水中，用漩渦混合器混勻后。采用熱煮沸法分別制備各個細(xì)菌的DNA模板。

1.2.3 雙重LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化 以ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌混合DNA為模板，主要對體系中Mg2+、dNTP、內(nèi)引物及反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化。鎂離子濃度設(shè)置為0.5、1、1.5、2、2.5、3 mmol/L；dNTP濃度設(shè)置為0.8、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L；內(nèi)引物濃度設(shè)置為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 μmol/L；多次重復(fù)試驗(yàn)后根據(jù)擴(kuò)增效果確定各組分最佳濃度。反應(yīng)溫度設(shè)置為60、61、62、63、64、65℃；反應(yīng)時間設(shè)置為15、30、45、60、75、90 min；同樣多次重復(fù)試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)溫度和時間。

1.2.4 雙重LAMP特異性試驗(yàn) 以葡萄球菌、巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、鴨疫里默菌、變形桿菌、鏈球菌、沙門菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌為檢測對象，同時以ETT2大腸埃希菌、HPI大腸埃希菌及ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌混合樣品為陽性對照，以超純水為陰性對照，采用本研究所建立的雙重LAMP檢測方法進(jìn)行檢測，驗(yàn)證雙重LAMP方法的特異性。

1.2.5 雙重LAMP靈敏性試驗(yàn) 測定試驗(yàn)菌株ETT2和HPI大腸埃希菌的DNA濃度，分別以超純水10倍倍比稀釋，各菌株每個梯度取 2 μL加入反應(yīng)體系，使得體系中ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌DNA量均為1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg，以超純水為陰性對照，分別利用雙重LAMP方法和雙重PCR方法進(jìn)行檢測，通過電泳結(jié)果對兩者靈敏度進(jìn)行評估。

1.2.6 雙重LAMP可視化檢測 按照優(yōu)化的條件配置好體系后，取1 μL SYBR Green Ⅰ 染料，反應(yīng)前滴加在反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)，小心操作以免將染料掉入反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束后倒置反應(yīng)管將染料和反應(yīng)液混勻，通過顏色變化確定反應(yīng)是否發(fā)生。

1.2.7 臨床樣品檢測 利用建立的雙重LAMP對采集的20份臨床樣品進(jìn)行檢測，同時采用常規(guī)PCR進(jìn)行檢測，比較兩種檢測方法的相符性。

2 結(jié)果

2.1 雙重LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果 通過對雙重LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化，最終確定LAMP反應(yīng)體系為：10×ThermoPol緩沖液2.5 μL，25 mmol/L MgCl21 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L外引物 ECs3703 F3/B3各0.5 μL，10 μmol/L內(nèi)引物ECs3703 FIP/BIP各2.5 μL，10 μmol/L外引物 irp2 F3/B3各0.5 μL，10 μmol/L內(nèi)引物irp2 FIP/BIP各2.5 μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶1 μL，ETT2大腸埃希菌DNA 2 μL，HPI大腸埃希菌DNA 2 μL，ddH2O 0.5 μL(圖1、圖2和圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～6.0.5 mmol/L、1 mmol/L、1.5 mmol/L、2 mmol/L、2.5 mmol/L、3 mmol/L；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.0.5 mmol/L，1 mmol/L，1.5 mmol/L，2 mmol/L，2.5 mmol/L，3 mmol/L；7.Negative control

圖1 氯化鎂的優(yōu)化

Fig.1 Result of the optimization of MgCl2

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～6.0.8 mmol/L、1 mmol/L、1.2 mmol/L、1.4 mmol/L、1.6 mmol/L、1.8 mmol/L；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.0.8 mmol/L，1 mmol/L，1.2 mmol/L，1.4 mmol/L，1.6 mmol/L，1.8 mmol/L；7.Negative control

圖2 dNTP的優(yōu)化

Fig.2 The optimization of dNTP

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ; 1～6.0.1 μmol/L、0.2μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1 μmol/L；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.0.1 μmol/L，0.2 μmol/L，0.4 μmol/L，0.6 μmol/L，0.8 μmol/L，1 μmol/L；7.Negative control

圖3 內(nèi)引物的優(yōu)化

Fig.3 The optimization of inter primer

2.1.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 通過對反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的優(yōu)化，最終確定最佳溫度為60℃(圖4)，最佳反應(yīng)時間為75 min(圖5)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1～6.60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃；7.Negative control

圖4 溫度的優(yōu)化

Fig.4 The optimization of temperature

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1～6.15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.15 min，30 min，45 min，60 min，75 min，90 min；7.Negative control

圖5 時間的優(yōu)化

Fig.5 The optimization of time

2.2 雙重LAMP特異性檢測結(jié)果

由圖6特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，對含有ETT2毒力島的大腸埃希菌、HPI毒力島的大腸埃希菌及ETT2和HPI大腸埃希菌混合樣品的檢測結(jié)果均為陽性，而其他8種非大腸埃希菌均顯示陰性，說明本方法特異性良好，可有效檢測含有ETT2和HPI毒力島的大腸埃希菌，而不與其他細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3 雙重LAMP靈敏性檢測結(jié)果

以倍比稀釋的ETT2和HPI毒力島大腸埃希菌的DNA為模板，分別進(jìn)行雙重LAMP和雙重PCR靈敏性檢測，結(jié)果顯示見圖7和圖8。雙重LAMP方法靈敏性比雙重PCR高100倍。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1.陰性對照；2～12.分別為ETT2大腸埃希菌、HPI大腸埃希菌、ETT2和HPI大腸埃希菌的混合、葡萄球菌、巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、鴨疫里默菌、變形桿菌、鏈球菌、沙門菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control；2-12.ETT2Escherichiacoli，HPIEscherichiacoli，ETT2 and HPIEscherichiacoli，Staphylococcus，Pasteurella，Erysipelas，Riemerellaanatipestifer，Proteus，Streptococcus，Salmonella，Clostridiumperfringens

圖6 雙重LAMP特異性試驗(yàn)

Fig.6 The specificity test of duplex LAMP

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1.陰性對照；2～8. 1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control；2-8.1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100 fg，10 fg，1 fg

圖7 雙重LAMP靈敏性試驗(yàn)

Fig.7 The sensitivity test of duplex LAMP

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1.陰性對照；2～8. 1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control;2-8. 1 ng,100 pg,10 pg,1 pg,100 fg,10 fg,1 fg

圖8 雙重PCR靈敏性試驗(yàn)

Fig.8 The sensitivity test of duplex PCR

2.4 雙重LAMP可視化檢測結(jié)果

擴(kuò)增結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，將管蓋內(nèi)側(cè)的染料與擴(kuò)增產(chǎn)物混勻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌的反應(yīng)管中反應(yīng)液顏色變?yōu)辄S色，而陰性對照仍然為橙色(圖9)。

1.陰性對照.2～4.分別為ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌的混合、ETT2大腸埃希菌、HPI大腸埃希菌

1.Negative control;2-4.ETT2 and HPIEscherichiacoli,ETT2Escherichiacoli,HPIEscherichiacoli

圖9 雙重LAMP可視化檢測

Fig.9 The visualization detection of duplex LAMP

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

對采集的20個臨床樣品進(jìn)行雙重LAMP檢測，結(jié)果有7份為陽性，然后利用常規(guī)PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2份同時含有ETT2和HPI毒力島，有2份為含有ETT2毒力島的大腸埃希菌，有3份為含有HPI毒力島的大腸埃希菌。

3 討論

在基層和現(xiàn)場疫病病原檢測中，檢測速度和疫病的進(jìn)一步防控有著密切的關(guān)系，同時，檢測方法的簡便性對于基層和現(xiàn)場檢測也至關(guān)重要。但在基層由于試驗(yàn)條件的局限性，常常無法實(shí)現(xiàn)較為復(fù)雜的檢測。因此，建立一種快速簡便、靈敏特異的方法對于基層和現(xiàn)場疫病檢測尤為重要。LAMP技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病毒檢測、細(xì)菌檢測、轉(zhuǎn)基因檢測、腫瘤檢測及胚胎性別鑒定[4-8]。而有關(guān)LAMP技術(shù)應(yīng)用的報道大部分都是單重LAMP檢測，近年來，為了滿足臨床疫病快速檢測的要求，人們逐漸向多重LAMP檢測的方向發(fā)展。袁向芬等[9]建立了豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的雙重RT-LAMP檢測方法，結(jié)果顯示，該方法的靈敏度與熒光定量RT-PCR相當(dāng)，比常規(guī)RT-PCR高10倍。趙軍等[10]針對蠟樣芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌的nhe、nuc基因設(shè)計了2套LAMP引物，并建立了檢測2種菌的二重LAMP檢測方法，結(jié)果表明，該二重LAMP檢測方法其靈敏度檢測限達(dá)10 fg/μL。陳兵等[11]建立了禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和傳染性法氏囊病病毒(IBDV)3種病毒的實(shí)時熒光多重反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(multiplex real-time revese transcription-LAMP,mRT-LAMP)檢測方法，結(jié)果表明，該mRT-LAMP檢測方法可對AIV、NDV、IBDV同時進(jìn)行篩選檢測，靈敏度可達(dá)到10個基因拷貝，與單項(xiàng)LAMP檢測的靈敏度相當(dāng)。

高特異性引物的設(shè)計是實(shí)現(xiàn)LAMP擴(kuò)增的關(guān)鍵，在多重LAMP反應(yīng)中，由于引物數(shù)量較多，使得反應(yīng)成分較為復(fù)雜，可能會引起競爭性抑制作用，影響反應(yīng)的準(zhǔn)確性和靈敏性，為了降低這種作用，必須根據(jù)引物設(shè)計原則更加合理地進(jìn)行引物的設(shè)計與篩選。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)引物對LAMP擴(kuò)增影響較大，因此，在多重LAMP反應(yīng)中進(jìn)行內(nèi)引物濃度的優(yōu)化是必要的。

本研究建立了大腸埃希菌ETT2毒力島和HPI毒力島的雙重LAMP檢測方法，經(jīng)過優(yōu)化確定了最佳反應(yīng)條件為鎂離子濃度1 mmol/L，dNTP濃度1.6 mmol/L，內(nèi)引物濃度1 μmol/L，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間75 min。在此條件下雙重LAMP同時檢測ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌DNA最低檢測限為100 fg。通過特異性試驗(yàn)表明所設(shè)計的兩套引物具有很好的特異性，擴(kuò)增結(jié)果可通過加入SYBR Green Ⅰ染料根據(jù)顏色變化判斷。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，本研究所建立的雙重LAMP檢測方法，具有耗時短，成本低廉，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，尤為適合基層和現(xiàn)場的疫病檢測。

[1] 張金寶,李曉娜,王桂琴.大腸埃希菌毒力基因研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(8):70-74.

[2] Schubert S,Rakin A,Karch H,et al.Prevalence of the “high pathogenicity island”ofYersiniaspecies amongEscherichiacolistrains that are pathogenic to humans[J].Infect Immun,1998,66:480-485.

[3] Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):E63.

[4] 鄭新添,黃翠琴,黃其春,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒LAMP檢測方法的建立與應(yīng)用[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(8):5-8.

[5] 卞 璐,張 旭.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)及其在食品檢測中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品,2016,10：43-46.

[6] Yang J F,Zhao C Z,Lu K X.Development and application of a rapid detection system for human papillomavirus and Herpes simplex virus-2 by loop-mediated isothermal amplification assay[J].Microb Pathog,2016,doi:10.1016/j.

[7] Centeno-Cuadros A,Abbasi I,Nathan R.Sex determination in the wild:a field application of loop-mediated isothermal amplification successfully determines sex across three raptor species[J].Mol Ecol Resour,2016,doi:10.1111/1755-0998.12540.

[8] Zhou D,Guo J,Xu L,Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) system for detection of cry1Ac transgenic sugarcane[J].Sci Rep,2014,doi:10.1038/srep04912.

[9] 袁向芬,吳紹強(qiáng),呂繼洲,等.豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙重RT-LAMP檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2015,45(7):721-728.

[10] 趙 軍,陳澤平,李 楨,等.二重LAMP檢測雞蛋污染致病菌[J].食品工業(yè)科技,2016,37(04):107-116.

[11] 陳 兵,孫 潔,陳書琨,等.三種家禽病毒多重RT-LAMP檢測方法的建立與應(yīng)用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2016(1):2-5.

Establishment of Duplex Loop-mediated Isothermal Amplification for Detecting Genes ofEscherichiacoliETT2 and HPI Pathogenicity Islands

CAI Shu-dong1,CHENG Da-rong1,ZHU Shan-yuan2,WU Shuang2,ZUO Wei-yong2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou,Jiangsu,225009,China；2.JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege，JiangsuVeterinaryBio-pharmaceuticalKeyLaboratoryofHigh-techResearch，Taizhou,Jiangsu,225300,China)

Two sets of loop-mediated isothermal amplification(LAMP) primers were designed according to the conserved nucleic acid sequences ofEscherichiacoliETT2 and HPI pathogenicity island genes in GenBank.In the same system of LAMP,by optimizing the system of Mg2+,dNTP,inter primer and reaction temperature,time, the duplex LAMP was established for simultaneous detection ofEscherichiacoliETT2 and HPI pathogenicity islands under the constant temperature of 60℃,and the specificity and sensitivity were tested.In result,the sensitivity of the duplex LAMP is 100 times higher than that of conventional PCR.Using the duplex LAMP, 8 strains of nonEscherichiacolishowed negative results.A total of 20 clinical samples were tested by duplex LAMP and duplex PCR,the result is consistent.In conclusion,the duplex LAMP method can be used for the rapid detection ofEscherichiacoliETT2 and HPI pathogenicity islands,as an effective means for the diagnosis of clinical disease.

Escherichiacoli; ETT2 pathogenicity island;HPI pathogenicity island;duplex LAMP

2016-06-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31440083); 江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目——校企合作基金項(xiàng)目(201512806029H)

蔡樹東(1991-),男,甘肅武威人,碩士研究生,主要從事預(yù)防獸醫(yī)微生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2017)01-0001-05