孫 雨，趙柏林，王曉英，董 浩，翟新驗(yàn)，曲 萍，胡冬梅，楊天意，石 慧，宋曉暉

(中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600)

小反芻獸疫病毒N蛋白原核表達(dá)與間接ELISA檢測(cè)方法的建立

孫 雨，趙柏林，王曉英，董 浩，翟新驗(yàn)，曲 萍，胡冬梅，楊天意，石 慧，宋曉暉*

(中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600)

小反芻獸疫病毒(PPRV)N蛋白是病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是診斷小反芻獸疫的主要靶蛋白。為獲得高效表達(dá)的可溶性N蛋白，并建立基于N蛋白的小反芻獸疫的間接ELISA檢測(cè)方法，通過(guò)優(yōu)化密碼子、優(yōu)化表達(dá)條件等條件探索，在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得了高效表達(dá)的可溶性N蛋白，進(jìn)一步基于N蛋白建立了間接ELISA檢測(cè)方法，該方法對(duì)其他相關(guān)的羊類病原無(wú)交叉反應(yīng)，其組內(nèi)與組間變異系數(shù)均低于9%，具有良好的重復(fù)性。對(duì)480份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用法國(guó)IDVET競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒進(jìn)行比較，符合率達(dá)到98.33%。本研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成熟的小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

小反芻獸疫；N活性蛋白；可溶性表達(dá)與純化；間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

小反芻獸疫(Peste des petitis ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petitis ruminants virus,PPRV)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，具有高發(fā)病率和高病死率的特點(diǎn)[1-5]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須上報(bào)的動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。該病主要感染綿羊、山羊等家養(yǎng)小反芻動(dòng)物及一些野生小反芻動(dòng)物,本病發(fā)病以口炎、發(fā)熱、腹瀉為主要特征[6]。該病于1942年首次在非洲的科特迪瓦發(fā)生，目前主要在非洲西部、中東、阿拉伯半島和南亞大陸等地流行[7-9]。2007年7月小反芻獸疫首次由境外傳入我國(guó)西藏阿里地區(qū)，疫情很快被控制。2013年11月底，小反芻獸疫再次傳入我國(guó)，疫情波及多個(gè)省份。2015年4月農(nóng)業(yè)部制定發(fā)布了《全國(guó)小反芻獸疫消滅計(jì)劃(2016-2020年)》，提出了到2020年，力爭(zhēng)全國(guó)達(dá)到小反芻獸疫非免疫無(wú)疫區(qū)標(biāo)準(zhǔn)。疫病的控制和消滅，離不開(kāi)有效的疫苗和快速敏感的檢測(cè)手段作為技術(shù)支撐。因此，加大快速有效、價(jià)格低廉的診斷檢測(cè)試劑的研發(fā)力度，加快推動(dòng)相關(guān)產(chǎn)品上市，能夠?yàn)槲覈?guó)的全國(guó)小反芻獸疫消滅計(jì)劃的實(shí)施提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

pET30a融合表達(dá)載體，Novagen公司產(chǎn)品；表達(dá)菌BL21(DE3)，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品； 限制性內(nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker DL2 000、SDS、IPTG、TaqPCR Master Mix，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖、DNA Extraction Kit、DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)粒快速提取試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；融合蛋白目的基因合成由華大基因生物科技有限公司完成；預(yù)染蛋白Marker，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，法國(guó)IDVET公司；陰性與陽(yáng)性樣本血清由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心草食動(dòng)物與人畜共患病室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)PPRV-N基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并分別在引物的5′端添加MluⅠ和3′端添加X(jué)hoⅠ酶切位點(diǎn)，用于目的片段的擴(kuò)增。

上游引物PPRV-NF:ggatccATGGCAACCTTACTGAAAAGTCTG

下游引物PPRV-NR:ctcgagTCAACCCAGCAGGTCTTTGTCGT

1.2.2 小反芻獸疫原核高效可溶性融合表達(dá)載體pET30a-N的構(gòu)建及鑒定 將pET30a載體進(jìn)行MluⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切體系為40 μL：10×酶切緩沖液4 μL，MluⅠ和XhoⅠ各1 μL，載體24 μL，去離子水8 μL，酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。然后將酶切好的載體與擴(kuò)增后的N編碼基因序列進(jìn)行連接，構(gòu)建10 μL的連接體系。其中，N編碼基因片段5.5 μL，pET30a載體1.5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，T4 DNA連接緩沖液2 μL。輕敲管壁，上下顛倒混勻之后瞬時(shí)離心，放22℃連接儀中連接4 h。將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及測(cè)序分析，將測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒命名為pET30a-N。

1.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 將pET30a-N連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)細(xì)胞中。無(wú)菌條件下，取適量BL21菌液加到LB(Kan+)固體培養(yǎng)基平板上，將菌液涂布均勻，待菌液完全吸收后，做好標(biāo)記，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)16 h。挑取單克隆菌落分別進(jìn)行菌液鑒定、酶切鑒定、菌液測(cè)序，確定N片段轉(zhuǎn)化進(jìn)pET30a載體中。

1.2.4 重組蛋白可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件的建立 將上述鑒定的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌E.coli1.BL21(DE3)中，挑取陽(yáng)性克隆，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液以1∶100接種于含卡那霉素(50 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD值為0.4～0.6時(shí)，取出l mL未誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照，其余液體中加入異丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。經(jīng)過(guò)對(duì)溫度、時(shí)間、IPTG濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定蛋白高效可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件為：0.75 mmol/L的IPTG濃度，過(guò)夜誘導(dǎo)13 h大量表達(dá)后，4℃、8000 r/min離心30 min收集菌體。經(jīng)過(guò)高壓大規(guī)模破碎菌體后，4℃條件下16 000 r/min離心30 min收集上清。

1.2.5 細(xì)菌蛋白表達(dá)形式的分析與鑒定 取 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)13 h后的菌液用于蛋白表達(dá)形式分析。具體步驟為，取1 mL誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5 mL離心管中，做好標(biāo)記，4℃條件下8000 r/min 離心30 min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入1 mL PBS重懸沉淀，8000 r/min 離心5 min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200 μL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再黏稠。于4℃離心機(jī)中16 000 r/min 離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，向剩余的沉淀中加入50 μL PBS重懸沉淀。向上清和沉淀中加入10 μL 5×SDS-PAGE loading buffe，充分混勻后，置沸水浴中煮沸5 min，待樣品冷卻后，用微型離心機(jī)瞬離。取6 μL用于SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 可溶性重組蛋白的AKTA系統(tǒng)高效純化方法 高壓破菌后，4℃、16000 r/min離心30 min，棄沉淀，保留上清。上清用0.22 μm濾膜過(guò)濾后上樣至預(yù)先用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 8.0的溶液平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機(jī)器上，分別用10個(gè)柱體積的20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 8.0的溶液與20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑pH 8.0的溶液清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)器上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑pH 8.0的溶液沖洗鎳柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品。

1.2.7 間接ELISA反應(yīng)條件的建立與優(yōu)化 采用棋盤(pán)方陣滴定法確定蛋白最適包被濃度和最佳血清稀釋度，以不同濃度的BSA封閉酶標(biāo)板確定最佳封閉液濃度，確定血清和酶標(biāo)二抗最佳工作時(shí)間，優(yōu)化酶標(biāo)二抗工作濃度，判定標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性血清與陰性血清的OD 450 nm比值(P/N)最大的孔所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件為ELISA方法的最佳反應(yīng)條件。

1.2.9 特異性試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA方法對(duì)羊布魯菌病、結(jié)核病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病、副結(jié)核病和口蹄疫陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，觀察與其他疾病有無(wú)交叉反應(yīng)。

1.2.10 敏感性試驗(yàn) 將已知的小反芻獸疫陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋，采用建立的間接ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用IDVET抗體檢測(cè)試劑盒做對(duì)比，得出陽(yáng)性臨界值時(shí)的最大稀釋度。

1.2.11 重復(fù)性試驗(yàn) 采用建立的間接ELISA方法對(duì)10份羊血清在同批次板和不同批次板上分別進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定5次，計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)(CV)。

1.2.12 符合性試驗(yàn) 采用建立的間接ELISA方法與IDVET公司生產(chǎn)的小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)法抗體診斷試劑盒對(duì)送檢的480份血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

使用MluⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒pET30a-N進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果表明，酶切產(chǎn)物于1 725 bp處出現(xiàn)一條明顯的條帶，說(shuō)明目的片段成功地克隆至pET30a載體中(圖1)。

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

將誘導(dǎo)后的菌體制樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明在63 ku處出現(xiàn)1條明顯的條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符，表明成功地獲得重組蛋白pET30a-N。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1.pET30a-N質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物; 2.質(zhì)粒鑒定

M.DNA Marker; 1.Products of plasmid pET30a-N digested byMluⅠ andXhoⅠ; 2.Identification of recombinant plasmid

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜

Fig.1 The map of recombinant plasmid identification

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2～5.陽(yáng)性克隆菌的蛋白預(yù)表達(dá)驗(yàn)證；6.陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)后的全菌；7.細(xì)菌破碎后的上清；8.細(xì)菌破碎后的沉淀

M.DNA Marker；1.Negative；2-5.Preexpressions of proteins；6.Positive bacteria clones；7.Bacterial supernatant after crushing；8.Bacterial precipitate after breaking

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein pET30a-N

2.3 細(xì)菌蛋白表達(dá)形式的分析與鑒定

通過(guò)SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達(dá)形式，結(jié)果融合蛋白均為可溶性表達(dá)。結(jié)果表明，本試驗(yàn)應(yīng)用pET30a構(gòu)建的pET30a-N載體，經(jīng)過(guò)可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件的不斷優(yōu)化，表達(dá)的可溶性重組蛋白占總蛋白的比例非常高。通過(guò)NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(ND2000)對(duì)得到的蛋白純度進(jìn)行定量分析，并且結(jié)合蛋白灰度分析軟件分析蛋白含量，結(jié)果表明本研究表達(dá)的小反芻獸疫N重組蛋白95%以上可溶。

2.4 可溶性蛋白的AKTA系統(tǒng)高效純化

將鎳柱接入AKTA系統(tǒng)上，分別用10個(gè)柱體積的20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 8.0的溶液與20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑pH 8.0的溶液清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)器上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑pH 8.0的溶液沖洗鎳柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品

2.5 間接ELISA方法的建立與優(yōu)化

將重組蛋白梯度稀釋后包被酶標(biāo)板，采用棋盤(pán)方陣滴定法確定重組蛋白N的包被量和血清稀釋度；并在抗原最佳包被濃度和血清稀釋度基礎(chǔ)上優(yōu)化ELISA 檢測(cè)條件。結(jié)果如表1 所示，pET30a-N的質(zhì)量濃度為5 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶200時(shí)，P/N值最大，因此確定抗原的最佳包被濃度為5 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶200。同時(shí)本試驗(yàn)確定HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG 按1∶20 000的比例稀釋，37℃作用1 h，加入TMB顯色液8 min后OD值最佳。

2.6 ELISA 陰陽(yáng)性臨界值確定

2.7 特異性試驗(yàn)

采用建立的間接ELISA方法對(duì)幾種羊源的病原(羊布病、結(jié)核病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病、副結(jié)核病和口蹄疫)陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，其OD 450 nm值分別為0.072、0.157、0.089、0.164、0.115，均小于臨界值0.325，表明重組蛋白pET30a-N與羊布病、結(jié)核病、產(chǎn)期莢膜梭菌病、副結(jié)核病和口蹄疫陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng)，該間接ELISA方法具有良好的特異性。

2.8 敏感性試驗(yàn)

將小反芻獸疫陽(yáng)性血清從1∶25開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋，采用重組蛋白pET30a-N作為包被抗原進(jìn)行檢測(cè)，稀釋度為1∶25 600 時(shí)仍呈陽(yáng)性，表明該方法敏感性較好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

以不同效價(jià)血清稀釋200倍后做平行重復(fù)ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)在2%～7%之間，批間重復(fù)變異系數(shù)小于9 %(表2)。結(jié)果表明，建立的間接ELISA檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

2.10 符合性試驗(yàn)

采用本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測(cè)方法和法國(guó)IDVET的小反芻獸疫抗體診斷試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的480份血清進(jìn)行檢測(cè)，其中使用該方法檢測(cè)陽(yáng)性率為23.76 %；法國(guó)IDVET公司生產(chǎn)的診斷試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性率為22.15 %，總符合率為98.33%。

表1 ELISA檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化

表2 間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)

3 討論

PPRV基因組共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)、多聚酶大蛋白(L)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H)[10]。其中，N蛋白由N基因翻譯，其ORF編碼的蛋白含有525個(gè)氨基酸，估計(jì)分子質(zhì)量為58 ku。該蛋白是目前已知的PPRV中含量最豐富和免疫原性最強(qiáng)的病毒蛋白。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)N蛋白主要作用是保護(hù)病毒免受核糖核酸酶1的降解，并與RNA結(jié)合參與病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程[11]。N蛋白的抗原性穩(wěn)定，在病毒感染的動(dòng)物血清中針對(duì)N蛋白的抗體占主導(dǎo)地位，是一個(gè)很好的作為診斷抗原的靶基因。但是，多數(shù)研究表達(dá)的小反芻獸疫N蛋白表達(dá)產(chǎn)物通常以不溶性的包涵體形式存在，具有可溶性的活性蛋白表達(dá)的報(bào)道較少[12]。包涵體蛋白的表達(dá)由于存在表達(dá)量不足以及空間結(jié)構(gòu)存在錯(cuò)誤折疊，不能形成高級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)與天然空間構(gòu)象表位，導(dǎo)致其作為診斷抗原不能形成很好的免疫空間表位。同時(shí)，包涵體中的表達(dá)產(chǎn)物不具有生物學(xué)活性，因而需要進(jìn)行變性與復(fù)性處理。蛋白的變性與復(fù)性是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，不同蛋白的復(fù)性條件各異，復(fù)性率往往很難提高。這是限制其應(yīng)用的主要制約因素。采用可溶性表達(dá)方式可很好的克服這一問(wèn)題。如何通過(guò)條件優(yōu)化，在大腸埃希菌中獲得表達(dá)量高并且可溶性好的蛋白，是本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)優(yōu)化密碼子、優(yōu)化表達(dá)條件等多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行反復(fù)探索，成功地在大腸埃希菌中獲得了可溶性高表達(dá)抗原。大腸埃希菌白表達(dá)水平高，生產(chǎn)成本低，利用大腸埃希菌獲得高表達(dá)的活性蛋白，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)商品化試劑盒奠定了一定的基礎(chǔ)。

近年來(lái)，針對(duì)小反芻獸疫診斷技術(shù)的研究較多。目前市場(chǎng)上銷售的用于檢測(cè)PPRV抗體的試劑盒主要為國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格昂貴，給基層小反芻獸疫檢測(cè)和監(jiān)測(cè)工作的開(kāi)展帶來(lái)一定的困難。本研究以高濃度可溶性的N蛋白作為包被抗原，所優(yōu)化建立的間接ELISA 檢測(cè)方法具有良好的特異性、敏感性與重復(fù)性，與其他幾種羊源疾病的陽(yáng)性血清無(wú)任何交叉反應(yīng)。取陽(yáng)性值較高的羊血清進(jìn)行稀釋后測(cè)定OD450 nm值，同時(shí)與法國(guó)IDVET公司生產(chǎn)的抗體檢測(cè)試劑盒做對(duì)比符合率達(dá)到98.33%，結(jié)果顯示該方法具有較好的敏感性和重復(fù)性。 結(jié)果表明本研究建立的間接ELISA方法可以很好地用于小反芻獸疫的臨床診斷。本研究基于大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的可溶性高表達(dá)的N蛋白，并依次建立的ELISA方法具有較高的特異性和靈敏性，進(jìn)一步可完善成為成熟的產(chǎn)品，用于基層小反芻獸疫疫苗免疫效果監(jiān)測(cè)等實(shí)際工作中，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。

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Prokaryotic Expression of N Protein of Peste des Petits Ruminants Virus and Development of Indirect ELISA

SUN Yu,ZHAO Bo-lin,WANG Xiao-ying,DONG Hao,ZHAI Xin-yan,QU Ping, HU Dong-mei,YANG Tian-yi,SHI Hui,SONG Xiao-hui

(ChinaAnimalDiseaseControlCenter,Beijing，102600,China)

Peste des petits ruminants virus (PPRV) N protein is the major structural protein of virus particles,and it is the main target protein in the diagnosis of PPRV.To establish the expression and purification methods for efficient soluble PPRV N protein and indirect ELISA method for diagnosis of PPRV based on N,this study got a high expression of soluble N protein inEscherichiacoliexpression system through optimization of codon and expression conditions,and established an indirect ELISA detection method based on N protein.The results showed that the assay was specific and repeatable.Furthermore,a total of 480 clinical serum samples were detected by this assay and the agreement was 98.33% with commercial ELISA Kit (IDVET).This study laid the foundation for the further development of kit for detection of PPRV antibody.

Peste des petits ruminants; N active protein; soluble expression and purification; indirect ELISA

2016-03-03

國(guó)家重點(diǎn)計(jì)劃研發(fā)項(xiàng)目(2016YFD0500901)

孫 雨(1983-)，男，山東高密人，獸醫(yī)師，博士，主要從事人畜共患病預(yù)防控制研究。*通訊作者

S852.659.5

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1007-5038(2017)01-0006-05