劉 升，孟露萍，張 輝，付 強，史慧君，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

bta-miR-205和bta-miR-497調(diào)控牛病毒性腹瀉病毒復制的研究

劉 升1，孟露萍1，張 輝1，付 強2，史慧君2，陳創(chuàng)夫1*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

為探究bta-miR-205和bta-miR-497對牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)復制的調(diào)控作用，在前期建立BVDV感染MDBK細胞miRNAs差異表達譜的基礎(chǔ)上，篩選出表達量顯著差異的bta-miR-205和bta-miR-497，通過生物信息學軟件預測、熒光素酶報告基因檢測等方法鑒定bta-miR-205和bta-miR-497的靶基因。應用RT-qPCR和病毒滴度測定等方法驗證bta-miR-205和bta-miR-497對BVDV復制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bta-miR-205能顯著抑制BVDV的復制，而bta-miR-497顯著促進BVDV的復制。研究結(jié)果為BVD防控提供了新的思路和依據(jù)。

牛病毒性腹瀉病毒；復制；bta-miR-205；bta-miR-497

隨著集約化養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的以發(fā)熱、腹瀉、黏膜糜爛潰瘍、懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎兒為主要特征的牛病毒性腹瀉-黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)已成為嚴重影響?zhàn)B牛業(yè)健康發(fā)展、造成全球養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟損失的主要病原[1-2]。BVDV還是牛源生物制品(如血清、凍精、胚胎、疫苗等)常在的污染源，嚴重影響畜牧業(yè)生產(chǎn)和科學研究工作[3]。但是由于BVDV與宿主細胞相互作用的分子機制、BVDV持續(xù)性感染和免疫抑制的分子機制尚未系統(tǒng)闡明，目前尚無有效的防控技術(shù)和手段。歐美等部分國家已開始實施以發(fā)現(xiàn)-撲殺為主的根除計劃，但這種手段不適用于我國的國情，導致該病在我國廣泛流行。

微小RNA(microRNA或miRNA)是一種廣泛存在于動物、植物等基因組中的微小非編碼RNA[4]。miRNAs調(diào)控人類近30%基因的表達，并且參與幾乎所有真核生物的生理和病理過程[5]。同時，隨著miRNA高通量測序平臺日新月異的變化，許多疾病異常表達的miRNAs被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，靶基因的預測和鑒定成為miRNAs功能研究的一個新切入點。

本研究在基于二代高通量測序建立的BVDV感染MDBK細胞miRNAs差異表達譜(Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫登錄號GSE61251)的基礎(chǔ)上，篩選出表達量顯著差異的miRNAs，并應用RT-qPCR和病毒滴度測定等方法驗證miRNAs對BVDV復制的影響，為利用miRNAs建立防控BVD的新技術(shù)提供理論依據(jù)，并為后續(xù)的抗病毒研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細胞與病毒 含BVDV NADL全長cDNA的pACNR/NADL質(zhì)粒，由美國洛克菲勒大學Charles M Rice友情惠贈；BVDV NADL毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；HEK-293FT和MDBK細胞均購自中國科學院上海細胞庫，并使用含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；大腸埃希菌DH5α，由石河子大學動物疫病防控兵團重點實驗室保存；雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)載體pmirGLO，為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 LightCycler 480型RT-qPCR儀，Roche公司產(chǎn)品；核酸定量儀Nanodrop 2000c、二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo公司產(chǎn)品；DYY-4C型高壓雙穩(wěn)電泳儀電源、DYCZ-24A型雙垂直電泳儀和DYCP-40C型半干式碳板轉(zhuǎn)印儀，北京六一公司產(chǎn)品；TE2000型熒光倒置顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品；PowerWave HT型酶標儀，Biotek公司產(chǎn)品；TECAN SUNRISE型酶標儀，TECAN公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 bta-miR-205-Antagomir(bta-miR-205的抑制劑片段)、bta-miR-205-agomir(bta-miR-205的成熟片段)、bta-miR-497-Antagomir(bta-miR-497的抑制劑片段)、bta-miR-497-agomir(bta-miR-497的成熟片段)、Stable negative control(陰性對照)均由上海吉瑪制藥公司合成；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(E1910)，Promega公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000，Invitrogen公司產(chǎn)品；DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清和DMSO，Gibco公司產(chǎn)品；SYBR Green Master Mix試劑盒，Roche公司產(chǎn)品；cDNA合成試劑盒，北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品；TRIzol細胞裂解液、TryPLE和NEAA，Life Tec公司產(chǎn)品；General AllGen kit(通用型柱式基因組提取試劑盒)、無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒，康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；其余分子生物學試劑，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 靶向BVDV NADL全基因組的miRNA預測 BVDV與丙型肝炎病毒(Hepatitis c virus，HCV)在基因組結(jié)構(gòu)上具有高度相似性，同時靶向于HCV基因組的miRNAs的種類和功能研究報道較為豐富。因此，首先使用Target Scan軟件搜索HCV感染人后差異表達的miRNAs，并且在miRBase數(shù)據(jù)庫中找到相應的miRNAs序列；將該miRNAs序列與前期建立的BVDV感染MDBK細胞miRNAs差異表達譜進行比對分析，尋找與牛同源的miRNAs序列；然后使用TargetScan、miRanda等生物信息學軟件預測這些miRNAs在BVDV NADL基因組中的靶位點。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中BVDV NADL基因組序列(登錄號NC-001461)，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計擴增miRNAs靶向于NS5B的3′端序列及RT-qPCR檢測E0基因的引物，擴增靶向于NS5B 3′端基因的引物序列見表1(劃線部分為酶切位點)。

以pACNR/NADL質(zhì)粒為模板，PCR擴增NS5B的3′端基因序列，PCR體系如表2所示。PCR條件為：95℃ 5 min；95℃ 40 s,64℃ 40 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果并回收目的基因；將回收產(chǎn)物與pMD 19-T載體進行過夜連接反應；連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中；涂布于含氨芐青霉素的固體LB上，倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h～16 h；挑取單克隆菌落置于含氨芐青霉素的液體LB中擴大培養(yǎng)4 h后，采用PCR方法鑒定單克隆菌落；將陽性的單克隆菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序鑒定。

表1 擴增NS5B 3′端基因的引物

表2 PCR反應體系

將測序正確的菌液接種到20.0 mL含氨芐青霉素的液體LB中，搖菌培養(yǎng)12 h～16 h后，按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒pMD19-T-NS5B-3′ end-1和pMD19-T-NS5B-3′ end-2；用核酸定量儀測定質(zhì)粒濃度，用XhoⅠ和SalⅠ酶切重組質(zhì)粒及雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)載體pmirGLO，酶切體系見表3，37℃水浴酶切4 h。

表3 雙酶切反應體系

用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物并使用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物；按照表4反應體系進行酶切產(chǎn)物的連接；連接反應過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中，并涂布到含氨芐青霉素的固體LB，靜置培養(yǎng)后挑取單克隆菌落、PCR鑒定、測序鑒定等步驟同上。

表4 連接體系

1.2.3 雙熒光素酶報告基因分析鑒定bta-miR-205和bta-miR-497的靶基因 按照無毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒pmirGLO-NS5B-3′ end-1和pmirGLO-NS5B-3′ end-2；用核酸定量儀測量重組質(zhì)粒的濃度和純度；按照1×104個/孔的密度將HEK-293FT細胞接種于明膠包被(每孔加入100 μL 1 g/L明膠溶液，靜置孵育過夜)的96孔細胞培養(yǎng)板中，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；待細胞匯合度達到80%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將構(gòu)建好的雙熒光素酶報告基因載體分別與bta-miR-205-Agomir/Antagomir、bta-miR-497-Agomir /Antagomir或negative control共轉(zhuǎn)染至HEK-293FT細胞，6 h后將培養(yǎng)基更換成含100 mL/L FBS的細胞完全培養(yǎng)液，此時刻記為轉(zhuǎn)染后0 h；轉(zhuǎn)染后36 h時，按照雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)試劑盒說明書分別測量螢火蟲熒光活性和海參熒光活性，并按照如下公式計算相對熒光活性：

相對熒光活性=(試驗組螢火蟲熒光活性/試驗組海腎熒光活性)/(對照組螢火蟲熒光活性/對照組海腎熒光活性)

1.2.4 RT-qPCR檢測bta-miR-205和bta-miR-497對BVDV NADL轉(zhuǎn)錄水平的影響 按照1.8×105個/孔的密度將MDBK細胞接種至12孔細胞培養(yǎng)板中；待細胞匯合度達到80%時，使用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染bta-miR-205-Agomir/Antagomir、bta-miR-497-Agomir/Antagomir或negative control至MDBK細胞中，6 h后更換培養(yǎng)基為含100 mL/L FBS的細胞完全培養(yǎng)液，此時刻記為轉(zhuǎn)染后0 h；轉(zhuǎn)染后36 h時加入BVDV NADL分別感染4 h和8 h；加入TRIzol裂解液裂解細胞，提取細胞總RNA，將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；使用RT-qPCR方法檢測BVDV NADL E0基因的轉(zhuǎn)錄水平變化[5]。

1.2.5 BVDV NADL感染miRNAs處理的MDBK細胞早期病毒滴度的檢測 按照如上方法接種MDBK細胞，并轉(zhuǎn)染bta-miR-205-Agomir/ Antagomir、bta-miR-497-Agomir/Antagomir或negative control；轉(zhuǎn)染后感染BVDV NADL；BVDV NADL感染后36 h時，反復凍融3次，收集病毒懸浮液，按Reed-Münch法測定病毒TCID50。

2 結(jié)果

2.1 bta-miR-205和bta-miR-497靶向BVDV NADL基因組的預測

用TargetScan、miRanda等生物信息學軟件預測bta-miR-205和bta-miR-497靶向BVDV NADL基因組可能的結(jié)合位點，結(jié)果如圖1所示。bta-miR-205和bta-miR-497能與BVDV NADL基因組中NS5B(RNA-dependent-RNA-polymerase，RdRp)序列以不完全互補的方式結(jié)合。

圖1 bta-miR-205和bta-miR-497在BVDV NADL基因組中的識別位點預測

2.2 重組雙熒光素酶報告基因載體的鑒定

雙酶切pmirGLO-NS5B-3′ end-1和pmirGLO-NS5B-3′ end-2重組質(zhì)粒，電泳結(jié)果出現(xiàn)3個條帶，分別是pmirGLO載體、NS5B-3′ end-1和NS5B-3′ end-2，大小分別為7 350、234、153 bp，與預期結(jié)果相符(圖2)。

1、6.PmirGLO-NS5B-3′ end-1和pmirGLO-NS5B-3′ end-2重組質(zhì)粒；2、3.酶切鑒定重組質(zhì)粒pmirGLO-NS5B-3′ end-1；4、5.酶切鑒定重組質(zhì)粒pmirGLO-NS5B-3′ end-2；M.DNA標準DL 10 000

1，6.PmirGLO-NS5B-3′ end-1 and pmirGLO-NS5B-3’end-2 recombinant plasmids,respectively; 2，3.Results of double enzyme digestion for pmirGLO-NS5B-3′ end-1; 4,5. Results of double enzyme digestion for pmirGLO-NS5B-3′ end-2; M.DNA Marker DL 10 000

圖2 重組雙熒光素酶報告基因載體酶切鑒定

Fig.2 Identification of recombinant dual-luciferase reporter vector by double enzyme digestion

2.3 雙熒光素酶報告基因分析鑒定bta-miR-205和bta-miR-497的靶基因

用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測bta-miR-205和bta-miR-497是否靶向于BVDV NADL基因組的NS5B基因。結(jié)果如圖3所示，bta-miR-205-Agomir/ Antagomir、bta-miR-497-Agomir /Antagomir和Stable陰性對照分別與重組雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO-NS5B-3′ end-1和pmirGLO-NS5B-3′ end-2共轉(zhuǎn)染后，試驗組與對照組相比，相對熒光素酶活性并沒有顯著性的變化。表明bta-miR-205和bta-miR-497并不直接靶向于BVDV NADL基因組中的NS5B基因(表5)。

2.4 RT-qPCR檢測bta-miR-205和bta-miR-497對BVDV轉(zhuǎn)錄水平的影響

MDBK細胞分別轉(zhuǎn)染bta-miR-205-Agomir/Antagomir、bta-miR-497-Agomir /Antagomir和Stable 陰性對照后感染BVDV NADL株，分別于感染后不同時間段，收集細胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-qPCR檢測bta-miR-205和bta-miR-497對BVDV轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染negative control相比，轉(zhuǎn)染后4 h和8 h，轉(zhuǎn)染bta-miR-205 agomir能顯著降低BVDV NADL E0 基因mRNA水平(P<0.01)，轉(zhuǎn)染bta-miR-205-antagomir能顯著升高BVDV NADL E0 基因mRNA水平(P<0.01)，表明bta-miR-205 agomir可抑制BVDV的復制。轉(zhuǎn)染bta-miR-497 agomir能顯著升高BVDV NADL E0 基因mRNA水平(P<0.01)，轉(zhuǎn)染bta-miR-497-antagomir能顯著降低BVDV NADL E0 基因mRNA水平(P<0.01)，表明bta-miR-497 agomir促進BVDV的復制。

圖3 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析bta-miR-205和bta-miR-497的靶位點

2.5 BVDV NADL感染miRNAs處理后的MDBK細胞早期的病毒滴度的檢測

MDBK細胞分別轉(zhuǎn)染bta-miR-205-agomir、bta-miR-497-agomir 和 Stable陰性對照后感染BVDV NADL，感染36 h后收集病毒懸液，用Reed- Münch法計算病毒懸液的TCID50。結(jié)果如表6所示，與陰性對照轉(zhuǎn)染的陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染bta-miR-205-agomir能抑制病毒的復制，而bta-miR-497-agomir轉(zhuǎn)染后則促進病毒的復制。

3 討論

miRNA是一類長度約為22 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，它可以通過誘導靶基因mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄后基因沉默來負向調(diào)節(jié)基因的表達，所以miRNA在細胞增殖、分化和死亡等一系列生理病理過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用[5-6]。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與病毒感染、復制和包裝等過程之間存在密切關(guān)系，影響著病毒的復制、免疫逃逸及宿主抗病毒等過程。通過對miRNA和病毒相互作用的研究，可以為病毒感染診斷及治療提供新的策略[7]。

表5 相對熒光活性

注：同行數(shù)據(jù)后標相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:Data with same letters indicate no significant difference (P>0.05).

表6 病毒懸液滴度測定

miRNA可以調(diào)節(jié)抗病毒免疫，有些可以抑制病毒的復制[8]，有些可能被病毒利用，促進其復制。Zheng S Q等[9]發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒感染宿主時，宿主細胞編碼的miR-101的表達量增加，會抑制ATP 5B的活性，減少細胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，從而影響病毒的復制。Wen B P等[10]發(fā)現(xiàn)宿主細胞編碼的miR-23b可通過作用于腸道病毒71型的3′UTR保守序列從而抑制EV71的復制。Li S等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-130通過恢復宿主先天免疫反應或下調(diào)pro-HCV miR-122的表達來抑制丙型肝炎病毒復制。Fang J等[12]發(fā)現(xiàn)在流感病毒感染的A549細胞及流感患者外周血單核細胞(PBMC)中，miR-29的表達上調(diào)了近50倍，并且miR-29可以抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的活性，從而誘導環(huán)氧化酶2(COX2)的表達，增強抗病毒的作用。然而，肝臟中特異性表達的miR-122有利于HCV的復制[13]。Jopling C L等[14]發(fā)現(xiàn)miR-4661可以直接靶向與IFN-α基因的mRNA的3′UTR，從而抑制皰疹性口炎病毒(VSV)和仙臺病毒(SeV)感染所引起的巨噬細胞和樹突狀細胞抗病毒免疫反應，從而促進病毒的復制。

多項研究表明，宿主編碼的miRNAs不僅可以通過間接作用調(diào)控病毒的復制，也可以直接靶向于病毒的某些結(jié)構(gòu)蛋白基因或非結(jié)構(gòu)蛋白基因，從而影響病毒的復制。本文預測到bta-miR-205和bta-miR-497這兩個miRNAs可能直接靶向于BVDV NADL基因組中NS5B基因，通過雙熒光素酶報告基因試驗得出bta-miR-205和bta-miR-497并不靶向于NS5B。BVDV NADL株侵染轉(zhuǎn)染bta-miR-205和bta-miR-497后的MDBK細胞，試驗結(jié)果表明，bta-miR-205抑制病毒的復制，bta-miR-497促進病毒的復制。至于bta-miR-205和bta-miR-497如何影響病毒的復制，它們作用的部位和方式是什么？后續(xù)的工作中將會繼續(xù)研究。

“**”表示差異顯著，P<0.01。

“**”means significant difference，P<0.01.

圖4 RT-qPCR檢測BVDV NADL E0的轉(zhuǎn)錄水平

Fig.4 Detection of BVDV NADL E0 transcription levels by real-time quantitative PCR

BVDV感染及在細胞內(nèi)的復制是病毒與宿主細胞之間相互作用、相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，目前BVDV感染動物后，沒有有效的治療方法，也沒有有效的疫苗可以用來免疫動物。因此，有必要尋求新的、安全有效的抗病毒治療策略。研究表明，miRNA在調(diào)控病毒復制方面扮演著非常重要的角色，所以對有效miRNA的篩選和深入研究十分迫切。其研究結(jié)果將有助于闡明BVDV的致病機制，同時還可以為BVDV感染的治療提供新的分子靶標。

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Study on Replication of Bovine Viral Diarrhea Virus Regulated by bta-miR-205 and bta-miR-497

LIU Sheng1,MENG Lu-ping1,ZHANG Hui1,FU Qiang2，SHI Hui-jun2，CHEN Chuang-fu1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832000,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China)

In order to explore the regulation effect of bta-miR-205 and bta-miR-497 on the bovine viral diarrhea virus(BVDV)' replication,based on the established miRNAs' differential expression profile of BVDV infected MDBK cells,the bta-miR-205 and bta-miR-497 with significantly different expressions were selected. The target genes of bta-miR-205 and bta-miR-497 were identified by the methods of bioinformatics software prediction and luciferase reporter gene verification. The effects of bta-miR-205 and bta-miR-497 on BVDV replication were verified by qRT-PCR and virus titer assay. The results showed that bta-miR-205 significantly inhibited the replication of BVDV, and bta-miR-497 significantly promoted the replication of BVDV. The study provided a new idea and basis for establishing a new technology to control BVDV.

Bovine viral diarrhea virus; bta-miR-205; bta-miR-497; replication

2016-06-20

國家自然科學基金項目(U1303283,31502095,31560328)；國際科技合作項目(2013DFR30970)

劉 升(1992-)，女，安徽蕭縣人，碩士研究生，主要從事分子病毒學研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)01-0015-06