汪 萍，劉麗婭，金映紅，沙依蘭·卡依扎，陸桂麗，夏 俊，成 進(jìn)

(新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊 830011)

一株雞源H9N2亞型禽流感病毒的致病性及其HA基因遺傳進(jìn)化分析

汪 萍，劉麗婭，金映紅，沙依蘭·卡依扎，陸桂麗*，夏 俊，成 進(jìn)

(新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊 830011)

為了解H9N2亞型禽流感病毒在新疆蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)的致病性及遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，對(duì)一株分離自蛋雞的禽流感病毒A/Chicken/Xinjiang/01/2010 (H9N2)進(jìn)行了致病性及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，分離株的MDT為92 h，ICPI指數(shù)為1.125，IVPI指數(shù)為0.14，HA裂解位點(diǎn)處氨基酸序列為335RSSRGLF342，這些特征均證實(shí)該分離株為低致病性AIV。HA基因遺傳進(jìn)化分析表明，該分離株在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上與A/swine/XJWLMQ/7/09(H9N2)及3株野生鳥(niǎo)類(lèi)新疆分離株的親緣關(guān)系最為接近，該分離株HA基因?qū)儆跉W亞譜系的A/chicken/Beijing/94(H9N2)和A/chicken/Hongkong/G9/97(H9N2)的一個(gè)分支。

禽流感病毒；H9N2亞型；蛋雞；致病性；遺傳進(jìn)化

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)人及哺乳動(dòng)物H9N2亞型禽流感病毒抗體的檢測(cè)顯示，人、豬、犬及貓等哺乳動(dòng)物體內(nèi)均可檢出H9N2亞型AIV抗體[1-3]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道的H9N2亞型AIV感染人的病例約17例，均未引起死亡[4-7]，但足以說(shuō)明H9N2亞型AIV已經(jīng)具備感染人的能力。雖然該亞型病毒尚不能在人與人之間傳播，但存在和其他亞型病毒重組產(chǎn)生新毒株的潛在危害。2013年，我國(guó)H7N9亞型流感病毒流行，最終證實(shí)該病毒是H7病毒的HA基因、N9病毒的NA基因及H9N2病毒的6個(gè)內(nèi)部基因片段組成的重配病毒[8]。本研究對(duì)從新疆蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)產(chǎn)蛋下降雞體內(nèi)分離的一株H9N2亞型禽流感病毒(命名為A/Chicken/Xinjiang/01/2010 (H9N2))進(jìn)行致病力及分子流行病學(xué)特點(diǎn)研究，以分析新疆分離株產(chǎn)生變異的位點(diǎn)及新疆分離毒株HA基因在H9N2亞型禽流感分類(lèi)中所處的分支，為新疆禽流感的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SPF雞胚 SPF雞胚購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.1.2 病毒、載體和宿主細(xì)胞 H9N2亞型禽流感病毒(A/Chicken/Xinjiang/01/2010)和E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所病毒室保存；pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 主要試劑 One Step RT-PCR Kit Ver.2、ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、DNA Fragment Purification Kit Ver.2、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2等,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Ampicillin trihydrate，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒致病性試驗(yàn)

1.2.1.1 雞胚最小致死量的平均致死時(shí)間(MDT)測(cè)定 將分離株3代毒液用PBS稀釋液做10倍系列稀釋?zhuān)臃N10日齡SPF雞胚，連續(xù)7 d在相應(yīng)接種時(shí)間記錄每一雞胚的死亡時(shí)間，并測(cè)定每胚尿囊液的HA活性，計(jì)算MDT值。1.2.1.2 腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)測(cè)定 將分離株3代毒液用PBS稀釋液1∶10稀釋后，經(jīng)腦內(nèi)接種10只1日齡SPF雞，每只接種 0.05 mL。連續(xù)8 d在相應(yīng)時(shí)間觀察雞群發(fā)病、死亡情況，計(jì)算ICPI值。1.2.1.3 靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)測(cè)定 將分離株3代毒液用PBS稀釋液1∶10稀釋后，經(jīng)翅靜脈接種10只6周齡SPF雞，每只 0.1 mL。連續(xù)觀察10 d，記錄發(fā)病和死亡情況。

1.2.2 HA基因的克隆

1.2.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的H9亞型禽流感病毒HA基因序列，用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列HA-U(5′-AGCAAAAgCAGGGGAATTT-3′)和HA-D(5′-TTATATACAAATGTTGCATCTGC-3′)。

1.2.2.2 RNA提取 吸取250 μL的雞胚尿囊液，按照 TRIZOL LS Reagent試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2.3 HA基因的RT-PCR擴(kuò)增 以提取的5 μL RNA溶液做模板，應(yīng)用HA-U和HA-D為引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 30 min；94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RT-PCR產(chǎn)物分析。

1.2.2.4 HA基因的鑒定 使用DNA Fragment Purification Kit Ver.2試劑盒對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接于pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有10 mg/mL Amp+的LB瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；隨機(jī)挑取單菌落接種于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)14 h；按照MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2試劑盒說(shuō)明提取質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。1.2.3 HA基因遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用MEGA6.06軟件對(duì)分離株HA序列與國(guó)內(nèi)外各AIV分支代表毒株的HA序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，參考毒株名稱(chēng)及登錄號(hào)見(jiàn)表1。

表1 H9N2亞型AIV參考毒株

1.2.4 HA蛋白質(zhì)氨基酸序列分析 應(yīng)用Lasergene7.1 DNA Star軟件對(duì)分離株的HA裂解位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MDT測(cè)定

接種10日齡SPF雞胚，該分離株可致雞胚死亡，胚體出現(xiàn)明顯的出血斑點(diǎn)(圖1)。MDT指數(shù)為92 h。

1、2.陰性對(duì)照；3、4.分離株感染雞胚

1 ，2.Negative control; 3，4.Isolated virus infected chicken embryos

圖1 分離病毒感染雞胚的病變

Fig.1 Isolated virus infected chicken embryos

2.2 ICPI測(cè)定

病毒接種1日齡SPF雞,1 d有1只雞發(fā)病，8 d共有10只雞發(fā)病死亡， ICPI指數(shù)為1.125。

2.3 IVPI測(cè)定

10只試驗(yàn)雞10 d內(nèi)死亡2只，IVPI指數(shù)為0.14。表明該禽流感分離株為低致病力毒株，對(duì)雞具有弱致病性。

2.4 HA基因的克隆

2.4.1 RT-PCR擴(kuò)增 用特異性引物成功擴(kuò)增出大小約1.7 kb的目的片段，與預(yù)期大小相符(圖2)。

1.HA基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

1.HA gene products；2.Negative control；M.DNA Marker DL 2 000

圖2 分離株HA基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 RT-PCR amplification result of HA gene of isolated virus

2.4.2 HA基因的克隆與鑒定 目的片段連接于pMD18-T載體上(圖3)；以重組質(zhì)粒為模板，用上述特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的約1.7 kb的目的片段，表明HA基因已成功克隆到pMD18-T載體上。

2.5 HA基因遺傳進(jìn)化分析

該分離株在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上與A/swine/XJWLMQ/7/09(H9N2)及3株野生鳥(niǎo)類(lèi)新疆分離株的親緣關(guān)系最為接近，其次與西北地區(qū)分離毒株，如陜西、寧夏、甘肅的H9N2亞型HA親緣關(guān)系較為接近。該分離株HA基因?qū)儆跉W亞譜系的Y280-Like 亞群的A/chicken/Beijing/1/94(H9N2)和A/chicken/Hongkong/G9/97(H9N2)的一個(gè)分支(圖4)。A/chicken/Beijing/1/94(H9N2)是中國(guó)最早分離的H9N2亞型的代表毒株，具有中國(guó)大陸AIV的地域特點(diǎn)，對(duì)雞可產(chǎn)生較高的病死率。A/chicken/Hongkong/G9/97(H9N2)僅對(duì)鼠有致病性。

2.6 HA蛋白氨基酸序列分析

HA裂解位點(diǎn)處氨基酸序列為335RSSRGLF342，為非連續(xù)的堿性氨基酸。存在8個(gè)糖基化位點(diǎn)分別為335RSSRGLF342，為非連續(xù)的堿性氨基酸。存在8個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為29NST、141NVS、218NRT、298NTT、305NVS、313NCS、492NGT、551NGS。與我國(guó)早期的分離株A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)比較，A/Chicken/Xinjiang/01/2010 (H9N2)、A/Chicken/Ningxia/1/2011(H9N2)、A/Chicken/shaanxixy/1/2012(H9N2)在第315位氨基酸由P突變?yōu)镾，增加了1個(gè)糖基化位點(diǎn)。

1、5.陽(yáng)性克?。?～4.陰性克?。籑.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000

1，5. Positive clones; 2-4.Negative clones；M.DNA Marker DL 15 000

圖3 HA基因克隆至pMD18-T載體的擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.3 Amplification products of HA gene cloned pMD18-T vector

圖4 分離株與參考株HA基因遺傳進(jìn)化分析

3 討論

我國(guó)對(duì)H9N2亞型禽流感的防控主要采取疫苗免疫預(yù)防的措施，但因其致病力較弱，感染后多表現(xiàn)為亞臨床癥狀而容易被忽視。近年來(lái)，H9N2亞型禽流感病毒不斷跨越種間屏障，感染人及哺乳動(dòng)物，且存在與其他亞型流感毒株重組產(chǎn)生新致病株的可能性，給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)重大隱患。因此，針對(duì)病毒的分子生物學(xué)特征開(kāi)展研究很必要。HA基因是流感病毒重要的糖蛋白，且該基因發(fā)生突變常會(huì)引起病毒抗原性改變。該基因的裂解位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)以及糖基化位點(diǎn)發(fā)生變化可能會(huì)影響病毒毒力、致病性、吸附能力和感染宿主范圍[9-12]。

本試驗(yàn)對(duì)一株分離自蛋雞的H9N2亞型AIV進(jìn)行了致病性試驗(yàn)，MDT指數(shù)、IVPI指數(shù)和ICPI指數(shù)均證明該毒株為低致病力毒株。HA基因序列分析表明，新疆分離株HA裂解位點(diǎn)處氨基酸序列為335RSSRGLF342，具有典型的低致病性毒株特點(diǎn)，該結(jié)論與致病性試驗(yàn)結(jié)果一致。HA蛋白糖基化位點(diǎn)在315位的氨基酸發(fā)生了突變，使糖基化位點(diǎn)由7位增加到8位。另外，第234位氨基酸受體結(jié)合位點(diǎn)為由Q突變?yōu)長(zhǎng)，表明病毒已經(jīng)可識(shí)別人呼吸道上皮細(xì)胞的唾液酸α 2,6-半乳糖，該分離株具有潛在感染人的能力[9,12-13]，應(yīng)該引起足夠重視。

禽流感病毒新疆分離株致病力試驗(yàn)及HA基因分子生物學(xué)分析證明該毒株為低致病力毒株，第234位氨基酸發(fā)生變異，與新疆AIV野鳥(niǎo)分離株、豬源分離株同處于一個(gè)小分支內(nèi)，親緣關(guān)系很近，新疆臨近省份的AIV分離株親緣關(guān)系也較近，提示根據(jù)地域特征制定針對(duì)野生鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳動(dòng)物、家禽流感的綜合防控措施具有非常重要的意義。

[1] Wang Q, Ju L, Liu P,et al.Serological and virological surveillance of avian influenza A virus H9N2 subtype in humans and poultry in shanghai,China,between 2008 and 2010[J].Zoonoses Public Health,2015,62(2):131-140.

[2] Butt K M,Smith G J,Chen H,et al.Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in 2003[J].J Clin Microbiol,2005,43:5760-5767.

[3] 劉秀梵.H5和H7亞型禽流感的防控[J].中國(guó)家禽,2013,35(22):7-8.

[4] 蔡訪(fǎng)潺,詹幼芳,黃建云,禽(h9n2)亞型流感病毒感染汕頭人群的報(bào)告[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2002(6):26-28.

[5] Peiris M,Yuen K Y,Leung C W,et al.Human infection with influenza H9N2 [J].Lancet，1999 (354):916-917.

[6] Cheng V C,Chan J F,Wen X,et al.Infection of immunocompromised patients by avian H9N2 influenza A virus[J].J Infect,2011,62:394-399.

[7] 汪 萍,夏 俊,參都哈什,等.新疆哺乳動(dòng)物流感病毒血清學(xué)監(jiān)測(cè)與分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,35(9):767-769.

[8] 黃欣梅,李 銀,劉宇卓,等.華東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒HA基因的遺傳演化分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,31(2)：382-388.

[9] 徐曉龍,包紅梅,陳化蘭,等.影響禽流感病毒致病性和傳播的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,36(2):165-168.

[10] Huang Yiwei,Zhang Hong,Li Xiaodan,et al.Detection and genetic characteristics of H9N2 avian influenza viruses from live poultry markets in Hunan Province,China[J].PLoS One,2015,10(11):e0142584. doi: 10.1371/journal.pone.

[11] Schrauwen E J A, Fouchier R A M.Host adaptation and transmission of influenza A viruses in mammals[J].Emerg Microbes Infect,2014,3(2):e9.

[12] de Graaf M, Fouchier R A M.Role of receptor binding specificity in influenza A virus transmission and pathogenesis[J].EMBO J,2014 ,33(8):823-841.

[13] Shi Weifeng,Li Wei,Li Xianbin,et al.Phylogenetics of varied subtypes of avian influenza viruses in China potential threat to humans [J].Protein Cell,2014,5(4) :253-257.

Pathogenicity and Phylogenetic Analysis of a H9N2 Subtype Avian Influenza Virus Isolated from Chicken

WANG Ping, LIU Li-ya, JIN Ying-hong, SHAYILAN·Ka-zha-yi, LU Gui-li, XIA Jun, CHENG Jin

(VeterinaryResearchInstitute,AnimalScienceAcademyofXinjiang,AnimalClinicalMedicineResearchCenter，AnimalScienceAcademyofXinjiang,Urumqi，Xinjiang，830011，China)

For understanding the pathogenicity and phylogenetic characteristics of avian influenza virus which isolated from laying hen in a egg chicken plant of Xinjiang,the pathogenicity and phylogenetic analysis of A/Chicken/Xinjiang/01/2010 (H9N2) were studied.The results indicated that the MDT,ICPI and IVPI of the isolated strain were 92h,1.125 and 0.14,respectively.The cleavage site of HA was 335RSSRGLF342.All of the above indicated that the isolated strain was LPAIV.Phylogenetic analysis of HA gene showed that the isolated strain has close relationship with A/swine/XJWLMQ/7/09(H9N2) and other three AIV which isolated from wild bird in Xinjiang.The isolated strain belongs to the branch of A/chicken/Beijing/94(H9N2) and A/chicken/Hongkong /G9/97(H9N2).

Avian influenza virus; H9N2 subtype; laying hen; pathogenicity; phylogenetic analysis

2016-05-27

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201103008)

汪 萍(1979-)，女，安徽碭山人，學(xué)士，主要從事家畜傳染病診斷及人畜共患病研究。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2017)01-0041-04