秦夢(mèng)雪，劉慶慧，萬(wàn)曉媛，黃 捷,3

(1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071)

中國(guó)部分地區(qū)對(duì)蝦白斑綜合征病毒膠原蛋白基因缺失變異分析

秦夢(mèng)雪1,2，劉慶慧1,3*，萬(wàn)曉媛1，黃 捷1,3

(1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071)

為了解我國(guó)主要對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)的白斑綜合征病毒 (WSSV)膠原蛋白基因(wsv001)蛋白結(jié)構(gòu)變異情況，以2015年13個(gè)省市發(fā)病地區(qū)采集的57份WSSV陽(yáng)性樣品為模板，用特異引物對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，連接轉(zhuǎn)化擴(kuò)增片段并進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，57份WSSV陽(yáng)性樣品中，擴(kuò)增出現(xiàn)條帶的樣品共有18份。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，擴(kuò)增的wsv001片段所編碼氨基酸出現(xiàn)三類變異，包括18個(gè)氨基酸小片段缺失，121個(gè)氨基酸大片段缺失及氨基酸插入，此外，還有8個(gè)氨基酸存在突變。結(jié)果表明，我國(guó)不同地區(qū)wsv001基因及其編碼氨基酸存在明顯缺失變異。對(duì)wsv001蛋白結(jié)構(gòu)缺失變異的分析，為進(jìn)一步對(duì)其蛋白功能和WSSV毒株毒力及WSSV對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的研究提供參考。

白斑綜合征病毒；膠原蛋白基因；缺失；變異；蛋白結(jié)構(gòu)

對(duì)蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是目前測(cè)序完成的最大的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物病毒。1997年，WSSV的病毒粒子從中國(guó)南美白對(duì)蝦中分離得到[1]。WSSV的暴發(fā)嚴(yán)重影響著水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，它的致死力強(qiáng)[2-3]，一般健康對(duì)蝦在感染3 d～7 d后，病死率高達(dá)90%～100%[4]。WSSV宿主范圍廣泛，可感染40余種甲殼綱動(dòng)物及水生浮游動(dòng)物[5]。WSSV是DNA雙鏈病毒，包含305 107個(gè)堿基，181個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)[6]。

對(duì)蝦白斑病毒在形態(tài)學(xué)上與昆蟲(chóng)桿狀病毒相似，但是這兩種病毒在氨基酸水平上存在明顯差異。相比于一些病毒基因，WSSV更象真核基因[7]。事實(shí)上，序列分析顯示，WSSV不同于目前任何已知病毒。盡管少量基因與皰疹病毒有輕微的同源性，但大部分ORF所編碼的蛋白質(zhì)與已知的任何蛋白質(zhì)不存在同源性。

WSSV最為特殊之處在于它自身存在一個(gè)完整的膠原蛋白基因(wsv001)。wsv001基因位于300501-445(ORF001)，編碼1 684個(gè)氨基酸[8-9]，這一ORF所編碼的產(chǎn)物顯示與人類Ⅶ膠原蛋白存在同源性(已經(jīng)確定42%超過(guò)1 336個(gè)氨基酸)，這是第一次在病毒中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)完整的膠原蛋白基因。該膠原蛋白包含1個(gè)典型的重復(fù)單元Gly-X-Y(X是脯氨酸Y可以是任何氨基酸)，可以形成三螺旋狀結(jié)構(gòu)[10-11]。Li Q等[12]認(rèn)為wsv001在WSSV感染機(jī)制中起到重要作用。同時(shí)Yang F等[8]認(rèn)為這個(gè)膠原蛋白基因的存在可能有助于WSSV適應(yīng)環(huán)境因素，或者有助于它們?cè)趯?duì)蝦池塘中的長(zhǎng)期生存。

目前,GenBank上公布的WSSV病毒株全序列共有4種，中國(guó)臺(tái)灣株(TW,AF440570)(307 287 bp)、中國(guó)株(CN,AF332093)(305 107 bp)、韓國(guó)株(KR,JX515788)及泰國(guó)株(TH,AF369029)(292 967 bp)[13]。WSSV毒株間最大的差異往往表現(xiàn)在ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94、ORF125的變化，對(duì)2013年-2015年我國(guó)典型對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)WSSV陽(yáng)性樣品的分析顯示,不同地區(qū)ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94、ORF125出現(xiàn)明顯變異[14-15]，但wsv001基因及其編碼的膠原蛋白是否變異尚不清楚。

本文針對(duì)WSSV不同毒株中wsv001基因的缺失突變情況進(jìn)行研究，為其蛋白結(jié)構(gòu)和功能分析及WSSV分子流行病學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 本試驗(yàn)中所涉及到的樣品是2015年WSSV暴發(fā)期間，采集于天津、山東、江蘇、浙江、廣東及海南6省(市)的病蝦。病料采集后，由黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室在-80℃超低溫冰箱保存。樣品編號(hào)、產(chǎn)地、品種及目的片段PCR擴(kuò)增情況見(jiàn)表1。DNA提取方法是將超低溫冰箱中保存的樣品解凍后，取鰓組織各30 mg，用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，提取各樣品DNA，保存于-20℃冰箱備用。

表1 WSSV樣本采集信息及wsv001擴(kuò)增情況

續(xù)表1

序號(hào)№樣品編號(hào)Sample№產(chǎn)地Site品種Species擴(kuò)增結(jié)果Amplificationresults47jc150709038天津北辰BeichenTianjin凡納濱對(duì)蝦L．vannamei+48jc150709039天津北辰BeichenTianjin凡納濱對(duì)蝦L．vannamei+49jc150720001廣東廣州GuangzhouGuangdong凡納濱對(duì)蝦L．vannamei-50jc150710001天津?qū)氎鍮aodiTianjin凡納濱對(duì)蝦L．vannamei-51jc150820001山東濰坊WeifangShandong凡納濱對(duì)蝦L．vannamei-52jc150820003山東濰坊WeifangShandong凡納濱對(duì)蝦L．vannamei-53jc150820004山東濰坊WeifangShandong凡納濱對(duì)蝦L．vannamei-54jc150820005山東濰坊WeifangShandong凡納濱對(duì)蝦L．vannamei-55jc150820006山東濰坊WeifangShandong凡納濱對(duì)蝦L．vannamei-56jc150820007山東濰坊WeifangShandong凡納濱對(duì)蝦L．vannamei-57jc150820008山東濰坊WeifangShandong凡納濱對(duì)蝦L．vannamei+

注:“-”表示未擴(kuò)增出，“+”表示擴(kuò)增出。

Note:“-”represents not amplified，“+”represents amplified.

1.1.2 試劑 ExTaqDNA聚合酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker DL 2 000)，TaKaRa公司產(chǎn)品；T5載體，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，New England Biolabs(NEB)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測(cè) 將提取的WSSV DNA 樣本按照GB/T 28630.2-2012 白斑綜合征(White spot disease,WSD)診斷規(guī)程第 2 部分套式PCR 檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。PCR產(chǎn)物通過(guò)TAE電泳緩沖液配制的10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.2 目的片段擴(kuò)增 由于wsv001基因編碼蛋白較大(1 684 aa)且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，選取第164到第401位氨基酸所對(duì)應(yīng)核酸進(jìn)行擴(kuò)增(即該基因的第488 bp到第1 205 bp)。用引物01s2 5′-AAAGTAAGGAAATTACATGGCCCGA-3′和01a2 5′-TCCAGTCTCTCCTCTTGGGCCTTGT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，59℃ 30 s， 72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將出現(xiàn)條帶的產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化。

1.2.3 基因克隆與序列分析 將純化好的PCR產(chǎn)物連接到T5載體中，借助卡那霉素進(jìn)行篩選以及菌液PCR初步鑒定，將菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果借助軟件DNA Man和NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)中所涉及到的57份樣品，通過(guò)PCR鑒定均呈WSSV陽(yáng)性。

2.2 目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

57份樣品中，PCR擴(kuò)增出現(xiàn)條帶的共計(jì)18份(9、13、14、15、16、17、18、32、33、34、35、36、37、45、46、47、48、57#)，檢出率為31.58%。其中山東利津、江蘇贛榆、天津漢沽、寶坻、海南?？诩皬V東廣州的樣品未檢出(圖1)。

2.3 序列比對(duì)

將wsv001部分序列的擴(kuò)增結(jié)果，與ORF2311(GenBank 登錄號(hào)：AY048547)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，測(cè)序樣品均出現(xiàn)不同程度的缺失或突變。將數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理后發(fā)現(xiàn)，共存在三大類變異情況：①18 個(gè)氨基酸小片段缺失(圖2)，出現(xiàn)在山東即墨、威海、昌邑及天津北辰的樣品中，除18 個(gè)氨基酸缺失外，山東昌邑(16#)樣品在309-373 aa缺失64個(gè)氨基酸，天津北辰(65#)樣品在172-194 aa缺失22個(gè)氨基酸。將檢測(cè)結(jié)果與原蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，顯示此類缺失出現(xiàn)在選取片段的右數(shù)第2個(gè)膠原超家族結(jié)構(gòu)(圖3);②121 個(gè)氨基酸大片段缺失(圖4)，出現(xiàn)在山東昌邑(15#、17#)、壽光(34#)和浙江舟山(33#)的樣品中，對(duì)比其蛋白結(jié)構(gòu)圖發(fā)現(xiàn)，缺失片段導(dǎo)致選取片段的右數(shù)第2個(gè)膠原超家族結(jié)構(gòu)消失(圖5)，這種缺失所造成的蛋白功能上的改變尚不清楚；③比較罕見(jiàn)的變異情況，即氨基酸插入情況(圖6)，在昌邑(13#)樣品中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，第253 aa后的20個(gè)氨基酸原序列中不存在，插入蛋白序列為-DGAVGPQGPPGERGENGRPGR-，蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，選取片段中的右數(shù)第2個(gè)膠原超家族結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(圖7)。山東濰坊(57#)樣品，第256 aa后多出GPA 3個(gè)氨基酸，比對(duì)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)其對(duì)wsv001的蛋白整體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

此外，氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)存在8個(gè)氨基酸突變，其中山東即墨和昌邑樣品中第288位谷氨酰胺突變?yōu)楦彼?；山東昌邑、壽光、天津北辰和浙江舟山的樣品中第364位谷氨酰胺突變?yōu)楦彼?；山東昌邑及壽光樣品中第366位精氨酸突變?yōu)楣劝彼?；山東濰坊的樣品中第377位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?14位丙氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，?10、311位丙氨酸、纈氨酸突變?yōu)榻z氨酸、異亮氨酸，第202位谷氨酰胺突變?yōu)楦彼?表2)。

A.樣品編號(hào)1～22; B.樣品編號(hào)23～44;C.樣品編號(hào)45～57;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；+.陽(yáng)性對(duì)照;-.陰性對(duì)照。

A.Number of samples 1-22; B:Number of samples 23-44; C.Number of samples 45-57; M.DNA Marker DL 2 000; +. Positive control;-. Negative control.

圖1 目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

左右兩邊的矩形表示用引物擴(kuò)增核酸編碼的蛋白序列，中間的虛線表示缺失的部分，矩形兩邊的數(shù)字表示與wsv001對(duì)應(yīng)的氨基酸位置

The right and left rectangles mean amino acids from sequences which can be amplified.The imaginary line in the middle means sequence deletion compared to wsv001.Figures on brackets indicate the originated and terminative positions corresponding to the wsv001

圖2 18個(gè)氨基酸小片段缺失示意圖

Fig.2 Deletion of 18 amino acids

圖3 18個(gè)氨基酸小片段缺失蛋白結(jié)構(gòu)圖

左右兩邊的矩形表示用引物擴(kuò)增出核酸編碼的蛋白序列，中間的虛線表示缺失的部分，矩形兩邊的數(shù)字表示與wsv001對(duì)應(yīng)的氨基酸位置

The right and left rectangles mean amino acids from sequences which can be amplified.The imaginary line in the middle means sequence deletion compared to wsv001.Figures on brackets indicate the originated and terminative positions corresponding to the wsv001

圖4 121個(gè)氨基酸大片段缺失示意圖

Fig.4 Deletion of 121 amino acids

圖5 121個(gè)氨基酸大片段缺失蛋白結(jié)構(gòu)圖

左右兩邊的矩形表示用引物擴(kuò)增出的蛋白序列，中間的虛線表示與選取片段蛋白序列進(jìn)行缺失的部分，矩形兩邊的數(shù)字表示與wsv001對(duì)應(yīng)的氨基酸位置

The right and left rectangles mean amino acids from sequences which can be amplified.The imaginary line in the middle means sequence deletion compared to wsv001.Figures on brackets indicate the originated and terminative positions corresponding to the wsv001

圖6 氨基酸插入示意圖

Fig.6 Insertion of amino acids

圖7 氨基酸插入蛋白結(jié)構(gòu)圖

3 討論

由于wsv001膠原蛋白基因較大(5 052 bp)，且基因缺失突變而致無(wú)法實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)基因擴(kuò)增。因此，本研究據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，選擇1個(gè)具有代表性的結(jié)構(gòu)域，即wsv001氨基酸第164位到401位進(jìn)行研究。選取片段擴(kuò)增結(jié)果顯示，有68.42%的樣品未出現(xiàn)條帶，可能由于樣品不完整或存在該區(qū)域的普遍性變異。

據(jù)測(cè)序結(jié)果分析，3種缺失變異情況均對(duì)膠原蛋白超家族結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。WSSV作為一種包膜病毒，膠原蛋白基因在其侵染宿主過(guò)程中起著非常重要的作用。同時(shí)，wsv001作為病毒早期基因，同其他早期基因一樣，當(dāng)病毒染色體進(jìn)入宿主細(xì)胞核后，隨即開(kāi)始轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這對(duì)病毒的復(fù)制至關(guān)重要，且通常對(duì)宿主細(xì)胞有毒害作用，造成宿主快速死亡。此前，病毒類的膠原蛋白只發(fā)現(xiàn)了LCDV這一種，但分子質(zhì)量較wsv001小很多[16]。高昀等[17]對(duì)wsv001部分片段的蛋白功能研究中發(fā)現(xiàn)，病毒對(duì)宿主腸和頭胸甲優(yōu)先入侵，并且膠原蛋白在行使功能的過(guò)程中存在自發(fā)降解可能。在膠原蛋白基因中，存在長(zhǎng)度從幾個(gè)到幾十個(gè)氨基酸長(zhǎng)度不等的非重復(fù)序列，一般將10個(gè)以上氨基酸組成的非重復(fù)序列稱為中斷區(qū)，是膠原蛋白空間結(jié)構(gòu)形成的重要因素。故推測(cè)非重復(fù)序列的缺失或變異直接或間接造成膠原蛋白超家族結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這種改變是否會(huì)影響WSSV的侵染過(guò)程尚不明確。

本文分析了WSSV中膠原蛋白基因的部分蛋白結(jié)構(gòu)在不同地區(qū)的缺失突變情況。結(jié)果表明，wsv001編碼氨基酸在第164到401位區(qū)域內(nèi)，存在明顯缺失突變情況，上述變異是否造成毒株的毒力差異和該膠原蛋白的功能改變，以及是否影響WSSV對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力尚待進(jìn)一步研究。

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Analysis of Collagen-like Protein Gene Deletion and Variation of WSSV in Shirmps from Different Parts of China

QIN Meng-xue1,2,LIU Qing-hui1,3,WAN Xiao-yuan1,HUANG Jie1,3

(1.KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries,MinistryofAgriculture,YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao,Shandong，266071，China; 2.CollegeFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai，201306，China; 3.FunctionLaboratoryforMarineFisheriesScienceandFoodProductionProcesses,QingdaoNationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,Qingdao，Shandong，266071，China)

To understand the white spot syndrome virus (WSSV) wsv001 protein structure variation in main shrimp culture regions of China, in this paper, the 57 WSSV-positive samples collected from 13 disease outbreak areas of China in 2015 were selected as templates. The products were obtained by PCR amplification with specific primer,and the amplified fragments were cloned and sequenced. Sequence aligment through cluster analysis showed that four samples had 18 amino acids deletion and three samples appeared 121 amino acids deletion. Furthermore, two samples showed 3 and 20 amino acids insertion, respectively. There is also 8 sites mutation of amino acids in some samples. All of the insertion or deletion mutations leaded to the structure change of collagen superfamily. In conclusion, wsv001 genes and their encoded amino acids had obvious deletion and variation in different areas of China. The results will benefit further study on the function of collagen protein, the virulence and environmental adaptation ability of WSSV.

White spot syndrome virus;collagen gene; deletion; variation; protein structure

2016-06-02

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2012CB114401)；農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2016-X56)

秦夢(mèng)雪(1990-)，女，河北唐山人，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S917.4

A

1007-5038(2017)01-0021-07