莊嘉瑯，曾　行，鐘國平，金　晶，茍曉麗，畢惠嫦，黃　民

(中山大學(xué)藥學(xué)院藥物代謝與藥動學(xué)實驗室，廣東 廣州　510006)

基于報告基因檢測的PXR、FXR和LXRα激動劑高通量篩選模型的建立

莊嘉瑯，曾行，鐘國平，金晶，茍曉麗，畢惠嫦，黃民

(中山大學(xué)藥學(xué)院藥物代謝與藥動學(xué)實驗室，廣東 廣州510006)

黃民(1963-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向: 臨床藥理學(xué)與藥物基因組學(xué)，E-mail: huangmin@mail.sysu.edu.cn

摘要：目的 建立基于報告基因法的高通量篩選細(xì)胞模型，用來發(fā)現(xiàn)PXR、FXR和LXRα受體激動劑。方法利用Real-time定量PCR方法比較HEK293、HepG2和LS174T細(xì)胞中內(nèi)源性核受體PXR、FXR和LXRα的表達量，將pSG5-hPXR和pGL3-XREM-CYP3A4、pEGFP-N3-hFXR和EcRE-TK-Luc、 pCMX-FLAG-hLXRα和pGL3-XREM-CYP3A4等質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染到工具細(xì)胞中，優(yōu)化共轉(zhuǎn)染比例，并考察陽性藥與螢光素酶報告基因表達強度的量效關(guān)系、模型特異性和穩(wěn)定性。結(jié)果① 根據(jù)Real-time定量PCR結(jié)果，模型選用低表達PXR、FXR和LXRα的HEK293細(xì)胞作為工具細(xì)胞；② 根據(jù)不同共轉(zhuǎn)染比例對報告基因活性的結(jié)果，PXR、FXR和LXRα報告基因藥物篩選模型的報告基因和過表達質(zhì)粒比例，最終分別選擇1 ∶1、2 ∶1和2 ∶1；③ 模型中，報告基因活性均與相應(yīng)陽性藥物(PXR/Rif、FXR/CDCA和LXRα/T0901317)呈劑量依賴性增長；④ 僅PXR激動劑Rif、FXR激動劑CDCA和LXRα激動劑T0901317可分別明顯增加相應(yīng)篩選模型的報告基因活性，分別重復(fù)5次試驗后，計算得Z′值分別為0.58、0.66和0.63。結(jié)論該研究建立的PXR、FXR和LXRα激動劑高通量篩選模型，具有良好的特異性和穩(wěn)定性，適用于對PXR、FXR和LXRα受體激動劑的篩選，進而開發(fā)以核受體作為藥物靶點的藥物。

關(guān)鍵詞：核受體；報告基因；高通量篩選；PXR；FXR；LXRα

核受體(nuclear receptors，NRs)為脂溶性配體依賴轉(zhuǎn)錄因子，現(xiàn)已明確核受體可根據(jù)配體分子的濃度調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄過程，在個體發(fā)育中參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，如形態(tài)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、機體穩(wěn)態(tài)維持、高級神經(jīng)功能控制以及決定細(xì)胞命運等重要生命現(xiàn)象中發(fā)揮作用[1]。人類核受體家族包含48個成員，例如PXR、FXR、LXR、PPAR、VDR、RXR等。近年來，核受體家族在代謝性疾病領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注，已有研究證明，它們與糖尿病、脂肪肝等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也被稱為代謝性核受體。

目前，針對核受體包括PXR、LXR和FXR的藥物篩選手段[2-4]包括：基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活檢測法、基于溶液的生物物理化學(xué)分析和基于計算機輔助的虛擬篩選等。相對而言，前者因基于生理狀態(tài)更為有效。高通量篩選技術(shù)已成為目前藥物篩選領(lǐng)域研究的重要課題[5]，針對靶標(biāo)的藥物研發(fā)過程可以分為靶標(biāo)的確立，先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，新藥的研發(fā)，其中高通量篩選技術(shù)是先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵，在藥物研發(fā)過程中起重要作用，由于其具有快速、微量、高效、經(jīng)濟的特點，這一技術(shù)必將在未來的藥物研究中發(fā)揮越來越重要的作用。而基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活檢測的報告基因篩選模型為高通量尋找新藥提供了可能[6-8]，通過將目的基因與雙報告基因共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中進行表達，配體結(jié)合到相應(yīng)的受體，激活下游信號通路，報告基因響應(yīng)這種信號的變化，使熒光素酶表達量發(fā)生變化。通過檢測細(xì)胞中雙報告基因熒光素酶的表達，來評估配體的功能和進行備選藥物的高通量篩選。

因此，我們通過將PXR、FXR和LXRα的過表達質(zhì)粒、相應(yīng)的報告基因質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK瞬時共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞，利用高通量篩選平臺檢測各種化合物作用后螢光素酶的熒光值來研究化合物對PXR、FXR和LXRα轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和試劑HEK293人胚腎細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞和LS174T人結(jié)腸癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由本實驗室保存；質(zhì)粒pEGFP-N3-hFXR由本實驗室構(gòu)建，質(zhì)粒pCMX-FLAG-hLXRα和EcRE-TK-Luc由美國匹茲堡大學(xué)謝文教授惠贈，質(zhì)粒pSG5-hPXR由美國德克薩斯州大學(xué)Steven Kliewer教授惠贈，質(zhì)粒pGL3-XREM-CYP3A4由美國堪薩斯大學(xué)Lawrence教授惠贈，質(zhì)粒pRL-TK和Dual-Luciferase Reporter Assay System 購自美國Promega公司；利福平(rifampicin，RIF)、鵝去氧膽酸 (chenodeoxycholic acid，CDCA)、T0901317、CITCO、羅格列酮 (rogiglitazone，Rog)、DMSO(dimethyl sulfoxide) 均購自Sigma公司，培養(yǎng)基DMEM、培養(yǎng)基RPMI 1640、胎牛血清和胰酶購自美國Hyclone公司； LipofectamineTM2000和OPTI-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。

1.1.2主要儀器SW-CJ-2FD型超凈化工作臺，蘇州蘇凈集團安泰公司； BB16型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國HERAEUS公司； XSZ-D2型顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；2.0 light cycler 定量PCR儀，羅氏公司；M1000全波長多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞接種取對數(shù)生長期的HEK293人胚腎細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞和LS174T人結(jié)腸癌細(xì)胞，以每孔5×104個細(xì)胞接種于96孔板中，每組做3個復(fù)孔，至細(xì)胞在96孔板中覆蓋率達到80%~85%時即可進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書，采用瞬時轉(zhuǎn)染法分別將下列質(zhì)粒與作為內(nèi)參的pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進不同細(xì)胞：(1) pSG5-hPXR和pGL3-XREM-CYP3A4，(2) pEGFP-N3-hFXR和EcRE-TK-Luc，(3) pCMX-FLAG-hLXRα和pGL3-XREM-CYP3A4。

1.2.3藥物處理細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后，更換含有藥物的培養(yǎng)基，設(shè)空白對照組、陽性藥物組和待測藥物組。藥物干預(yù)24 h后進行雙螢光素酶報告基因檢測。

1.2.4雙熒光報告基因的檢測藥物作用24 h后，去除培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，PBS溶液洗滌細(xì)胞1次，小心去除PBS溶液，每個培養(yǎng)孔中加入20 μL 1×PLB溶液，室溫下震蕩20 min。每孔再加入20 μL LARII溶液，檢測螢火蟲螢光素酶活性；再加入20 μL Stop & Glo?Reagent，啟動海腎螢光素酶反應(yīng)，檢測海腎螢光素酶活性。

1.2.5結(jié)果分析每孔的螢光素酶活性值用海腎螢光素酶的活性進行校正，故最后每樣品孔校正酶活性為：螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶的活性值。相對熒光素酶活性=實驗組熒光素酶活性/溶媒組熒光素酶活性。

1.2.6實時熒光定量PCR按TRIzol(Invitrogen)說明書步驟提取不同細(xì)胞株的總RNA，參照TaKaRa公司RT-PCR試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行熒光定量PCR檢測。使用的引物序列如下Tab 1所示。

Tab 1　Primer sequences for RT-qPCR

按以下設(shè)置參數(shù)進行：94℃×1 min→95℃×30 s，59℃×30 s，72℃×30 s(45個循環(huán))→95℃×10 s→65℃×45 s→40℃×60 s。選擇GADPH為內(nèi)參，通過檢測目的基因相對于內(nèi)參基因的表達變化來定量。采用GAPDH為內(nèi)參照,以空白組為對照。2-ΔΔCt方法來分析數(shù)據(jù)：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，ΔΔCt =ΔCt樣品-ΔCt對照。計算2-ΔΔCt的數(shù)值即為實驗組目的基因相對于對照組的表達量的變化倍數(shù)。

1.2.7模型特異性和穩(wěn)定性考察分別使用Rog和CITCO等經(jīng)典核受體激動劑來刺激細(xì)胞，并與相應(yīng)陽性對照組進行對比；選擇國際公認(rèn)的統(tǒng)計學(xué)參數(shù)Z′因子以確認(rèn)篩選模型是否符合高通量篩選的要求，采用Z′因子分析法來進行評估，其計算公式為:

其中μC+：陽性對照組的平均值，μC-：陰性對照組的平均值；σC+：陽性對照組的標(biāo)準(zhǔn)偏差，σC-：陰性對照組的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞株的選擇為了消除內(nèi)源性核受體對后續(xù)報告基因檢測的影響，我們用RT-qPCR法檢測了HEK293、HepG2和LS174T各細(xì)胞株中PXR、FXR和LXRα基因mRNA水平的表達，結(jié)果如Fig 1所示，HepG2細(xì)胞中PXR和FXR基因表達與其他兩株細(xì)胞相比相對較高，LS174T和HepG2細(xì)胞中LXRα基因表達明顯比HEk293細(xì)胞高，最后我們發(fā)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞中PXR、FXR和LXRα基因表達水平都相對較低。結(jié)合HEK293細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高，培養(yǎng)傳代容易等優(yōu)點，我們選用其作為核受體報告基因的藥物高通量篩選模型的轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。

Fig 1The mRNA expression of PXR, FXR and

**,## and △△P<0.01vsPXR, FXR and LXRα mRNA for HEK293.

2.2共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒比例的優(yōu)化在過表達質(zhì)粒、報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的實驗中，為得到最佳的誘導(dǎo)效應(yīng)，在總質(zhì)粒量為200ng和pRL-TK為3ng不變的情況下，我們比較了報告基因質(zhì)粒和過表達質(zhì)粒的比例為10 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶10幾種情況下陽性藥物(10 μmol·L-1Rif、10 μmol·L-1CDCA和10 μmol·L-1T0901317)對核受體的激動作用。根據(jù)Tab 2所示，本研究對于PXR、FXR和LXRα報告基因藥物篩選模型的報告基因和過表達質(zhì)粒比例最終分別選擇1 ∶1、2 ∶1和2 ∶1。

Tab 2Effects of different plasmid ratios on fold of induction

ReportergeneassayReporterplasmid∶expressionplasmid10∶12∶11∶11∶21∶10PXR6.02±0.627.87±1.158.27±1.077.53±0.864.57±0.42FXR4.64±1.2010.98±0.899.43±0.888.49±1.093.98±0.36LXRα8.98±0.8011.77±2.199.48±2.456.89±1.127.38±0.97

2.3陽性藥與螢光素酶報告基因表達強度的量效關(guān)系根據(jù)所得到的最佳轉(zhuǎn)染條件進行轉(zhuǎn)染后給予相應(yīng)陽性藥，藥物刺激24 h后檢測雙螢光素酶活性，結(jié)果如Fig 2所示，相對熒光素酶活性均與陽性藥物呈劑量依賴性增長，其中，50 μmol·L-1RIf的誘導(dǎo)倍數(shù)可達到8左右，100 μmol·L-1CDCA時最高可達到30左右，5和10 μmol·L-1T0901317時最高可達到18以上。

2.4模型特異性和穩(wěn)定性考察采用PXR激動劑Rif、FXR激動劑CDCA、LXRα激動劑T0901317、PPARγ激動劑Rog和組成型雄甾烷CAR受體激動劑CITCO對這3種核受體藥物篩選模型的特異性進行考察。使用不同濃度的受試藥物處理轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞，24 h后檢測相對螢光素酶活性。結(jié)果如Fig 3所示，只有PXR陽性激動劑Rif、FXR陽性激動劑CDCA和LXRα陽性激動劑T0901317可對相對熒光素酶活性產(chǎn)生良好誘導(dǎo)，其他核受體激動劑都不能對PXR、FXR和LXRα產(chǎn)生激動作用。值得注意的是，由于T0901317為LXRα和PXR雙激動劑，因此T0901317在PXR報告基因藥物篩選模型中也能產(chǎn)生明顯的螢光素酶活性。

按已確定的轉(zhuǎn)染條件分別瞬轉(zhuǎn)入PXR、FXR和LXRα的過表達質(zhì)粒和報告基因質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK的HEK293細(xì)胞給予相應(yīng)陽性藥，藥物刺激24 h后檢測雙螢光素酶活性，根據(jù)方法“1.2.7”計算出PXR、FXR和LXRα藥物高通量篩選模型的Z′因子，結(jié)果如Tab 3所示。結(jié)果表明，PXR、FXR和LXRα藥物篩選模型的Z'因子均高于0.5；一般認(rèn)為Z′因子值大于0.5時，說明該高通量篩選方法為比較理想的實驗方法，可以接受，故這些模型的穩(wěn)定性良好，可用于高通量篩選。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Tab 3　Z′ factor of 96-well plates for PXR, FXR and

3討論

近年有研究認(rèn)為[10]，PXR和LXRα存在交叉協(xié)同作用，由于PXR和LXRα配體結(jié)合域的蛋白結(jié)構(gòu)組成具有50%的同源性，因此部分外源物(如T0901317)可同時激活這兩種受體，PXR與LXRα均能夠與CYP3A基因中dNR1和eNR3A4元件相結(jié)合是PXR- CYP3A和LXRα-CYP3A途徑相互交叉的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。據(jù)此本研究以XREM作為報告基因的靶序列，建立了PXR和LXRα的藥物高通量篩選模型。而另一方面，蛻皮激素響應(yīng)元件 ecdysone response element(EcRE)[11]能被FXR的DNA結(jié)合域(DBD)所結(jié)合并啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，故本研究選用FXR的內(nèi)源報告基因EcRE和有本實驗室構(gòu)建的含F(xiàn)XR全長序列的pEGFP-N3-hFXR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，建立了FXR的藥物高通量篩選模型。

目前，在細(xì)胞水平上基于核受體為治療靶點進行藥物篩選和評價的手段中，雙螢光素酶報告基因檢測法是現(xiàn)在開展高通量藥物篩選研究用得最多的方法，該方法在傳統(tǒng)的單螢光素酶報告基因檢測法的基礎(chǔ)上，加入了海腎螢光素酶報告基因作為內(nèi)參對照，將實驗報告基因的活力與內(nèi)對照報告基因的活力作歸一化，可消除實驗中不同測試間所固有的變化，提高了檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度，操作簡便，符合高通量藥物篩選的特點。同時，本研究選用內(nèi)源性PXR、FXR和LXRα低表達的HEK293細(xì)胞作為高通量藥物篩選模型的細(xì)胞載體，在加入不同濃度的Rif、CDCA或T0901317處理24 h后，發(fā)現(xiàn)PXR、FXR或LXRα的螢光素酶活性均明顯升高，并呈現(xiàn)濃度依賴性上升。而另一方面，其他核受體激動劑如PPARγ激動劑Rog或CAR激動劑CITCO對細(xì)胞螢光素酶活性均無明顯影響，該結(jié)果說明PXR、FXR和LXRα高通量藥物篩選模型具有一定的特異性。進一步采用國際上公認(rèn)的Z′因子對PXR、FXR和LXRα高通量藥物篩選模型的穩(wěn)定性進行評價，實驗結(jié)果顯示PXR、FXR和LXRα高通量藥物篩選模型的Z′因子均大于0.5(分別為0.58、0.66和0.63)，顯示這3種高通量藥物篩選模型具有良好的穩(wěn)定性。

細(xì)胞核受體是許多疾病重要的藥物靶點[12]，當(dāng)前，以核受體為靶點已經(jīng)成為抗腫瘤和代謝性疾病藥物研究的新熱點。PXR作為人體內(nèi)“最主要的異物感感受器”，是 CYP3A4 基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)控因子，對異源物(食物、藥物和其他成分)的代謝中起到了關(guān)鍵作用，PXR可以通過促進藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運蛋白的表達來應(yīng)對藥物及其他外來化學(xué)物質(zhì)，進而影響它們的生物轉(zhuǎn)化率，并將其清除出體外。本實驗室前期研究結(jié)果[13-14]發(fā)現(xiàn)多種中藥單體在建立于HepG2或Huh7細(xì)胞的PXR-CYP3A4 報告基因檢測體系中，均能經(jīng)過PXR受體通路誘導(dǎo)CYP3A4 熒光素酶的表達，這為研究中藥代謝與中藥-化學(xué)藥相互作用和中藥配伍毒性提供了新的思路和方法，因此本研究中的PXR高通量藥物篩選模型也是本實驗室前期對PXR報告基因檢測體系研究的發(fā)展。

隨著對核受體研究的深入，脂質(zhì)、葡萄糖代謝已經(jīng)與Ⅱ型糖尿病、肥胖和動脈粥樣硬化這類疾病聯(lián)系起來，在疾病的治療和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。FXR和LXRα作為體內(nèi)重要的代謝調(diào)節(jié)因子，前者的激活能夠維持膽汁酸在肝臟和小腸中的正常循環(huán)和穩(wěn)態(tài)，同時能夠調(diào)節(jié)糖類、脂類和膽固醇的水平，成為治療代謝疾病(如膽汁阻塞、膽結(jié)石、非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化和糖尿病等)出色的藥物靶分子；而后者作為一種體內(nèi)膽固醇感受器，可控制脂肪和膽固醇的合成、吸收、轉(zhuǎn)運及分解，調(diào)控機體的脂肪和膽固醇平衡，同時由于其具有的抗炎作用，使得LXRα的激動劑有望成為非他汀類的治療高膽固醇、肥胖癥和動脈粥樣硬化的極具潛力的新藥靶點。LXRα的激動劑成為治療人體中由于膽固醇代謝、脂代謝和糖代謝的平衡紊亂而導(dǎo)致的包括糖尿病、高血脂、高膽固醇、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、肥胖癥和代謝綜合癥等多種疾病的治療藥物。因此，篩選以FXR和LXRα為靶標(biāo)的藥物具有重要的應(yīng)用價值。目前世界各大制藥公司和研發(fā)機構(gòu)都在積極進行FXR和LXRα激動劑藥物的研發(fā)，并有諸多化合物進行了專利申請。

本研究建立的以檢測PXR、FXR和LXRα靶基因表達的雙螢光素酶報告基因篩選模型，是一種快捷有效的高通量篩選工具，可進一步篩選具有PXR、FXR或LXRα激動劑活性的化學(xué)合成物、天然藥物或食物成分。

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網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.028.html

◇實驗方法學(xué)◇

Establishment of cell models for PXR, FXR and LXRα agonists

high-throughput screening based on reporter gene assay

ZHUANG Jia-lang，ZENG Hang，ZHONG Guo-ping，JIN Jing，Gou Xiao-li，BI Hui-chang， HUANG Min

(LaboratoryofDrugMetabolismandPharmacokinetics，SchoolofPharmaceuticalSciences，

SunYat-SenUniversity，Guangzhou510006，China)

Abstract：AimTo develop an in vitro high throughput drug screening system based on reporter gene assay for identification of novel compounds with PXR, FXR and LXRα agonist activity. MethodsThe expressions of exogenous PXR, FXR and LXRα gene in HEK293, HepG2 and LS174T cells were examined by Real-Time quantity PCR. pSG5-hPXR and pGL3-XREM-CYP3A4, pEGFP-N3-hFXR and EcRE-TK-Luc, pCMX-FLAG-hLXRα and pGL3-XREM-CYP3A4 were cotransfected into cells and the optimal ratio of three plasmids was determined. The dose-response relationship between the positive drug and the fold induction was determined. The specificity of the model was examined, and the repeatability was also determined by Z′ value. Results① The PXR，F(xiàn)XR and LXRα mRNA expression in HEK293 cell is low among three different cells. ② reporter gene vector and expression plasmid ratio of 1 ∶1, 2 ∶1 and 2 ∶1 were proved to be suitable for highest relative luciferase activity for PXR, FXR or LXRα agonist screening model. ③ The relative luciferase activity was induced by Rif, CDCA or T0901317 in a dose-dependent manner. ④ Only Rif, CDCA or T0901317 could significantly increase the relative luciferase activity in PXR，F(xiàn)XR or LXRα agonist screening model, no effect of other nuclear receptors agonist was observed, and the values of Z′-factor for PXR, FXR and LXRα agonist screening model were 0.58, 0.66 and 0.63,respectively. ConclusionAn in vitro PXR, FXR and LXRα agonist high-throughput screening models are developed with acceptable specificity and repeatability, and the models can be used to screen PXR, FXR and LXRα agonist.

Key words：nuclear receptor；reporter gene；high-throughput screening；PXR；FXR；LXRα

作者簡介：莊嘉瑯(1990-)，男，碩士生，研究方向: 臨床藥理學(xué)與藥物基因組學(xué),E-mail:zhjial2@mail2.sysu.edu.cn;

基金項目：廣東省新藥設(shè)計與評價重點實驗室開放基金(No 2011 A060901014-009)

收稿日期:2014-10-10,修回日期:2014-11-05

文獻標(biāo)志碼：中國圖書分類號：R392.11；R394.2；R394.3；R965.1

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.028