張祖勇 程洪強(qiáng) 董曉巧 王昊 張仕蓉

腦膠質(zhì)瘤小鼠模型構(gòu)建研究進(jìn)展

張祖勇 程洪強(qiáng) 董曉巧 王昊 張仕蓉

腦膠質(zhì)瘤（glioma）是一種常見(jiàn)的腦腫瘤，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)等組織學(xué)特征，可以分成Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ、Ⅱ級(jí)為進(jìn)展慢，惡性程度低的低級(jí)別膠質(zhì)瘤；而Ⅲ、Ⅳ級(jí)為惡性程度高的高級(jí)別腫瘤，包括最常見(jiàn)的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度高，患者生存時(shí)間短，1年生存率＜50%，5年生存率＜5%［1］。世界衛(wèi)生組織建議根據(jù)基因突變的分子病理特征對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行分型，指導(dǎo)患者的管理和藥物使用［2-4］。目前對(duì)膠質(zhì)瘤的治療方法主要是手術(shù)切除，輔助以術(shù)后放化療。由于膠質(zhì)瘤的高度侵襲性無(wú)法完全去除腫瘤細(xì)胞。血腦屏障的存在降低化療藥物治療效果，膠質(zhì)瘤患者術(shù)后易復(fù)發(fā)［1］。對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子與細(xì)胞水平的認(rèn)識(shí)及新型治療藥物的研發(fā)均需要模式生物［5］。本文對(duì)膠質(zhì)瘤研究中的小鼠模型進(jìn)行綜述。

1 化學(xué)誘變

上世紀(jì)70年代用致癌劑誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生彌漫性膠質(zhì)瘤是早期廣泛使用的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型。孕鼠尾靜脈注射亞硝基硫脲（N-ethyl-N-Nitrosourea，NEU）導(dǎo)致多數(shù)宮內(nèi)暴露致癌劑仔鼠發(fā)生膠質(zhì)瘤（成年動(dòng)物注射致癌劑不能產(chǎn)生腦瘤）［6］。對(duì)化學(xué)誘變產(chǎn)生的膠質(zhì)瘤進(jìn)行基因變異分析，發(fā)現(xiàn)存在與臨床一致的p53突變和PDGFR/EGFR基因拷貝數(shù)增加等基因變異［7］?；瘜W(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生的膠質(zhì)瘤較好模擬了臨床上膠質(zhì)瘤的遺傳異質(zhì)性，同時(shí)保全小鼠的免疫系統(tǒng)和血腦屏障。然而由于基因突變的隨機(jī)性導(dǎo)致膠質(zhì)瘤生成重復(fù)性差（如腫瘤發(fā)生率，惡性程度，腫瘤類型與位置等）不足，現(xiàn)已較少使用這種小鼠模型研究膠質(zhì)瘤。

現(xiàn)在普遍使用的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，如9L，C6，GL261及CNS-1等，來(lái)自化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠或小鼠膠質(zhì)瘤模型［8］。C6細(xì)胞株來(lái)自甲基硫脲處理的大鼠，組化與腫瘤標(biāo)志物與人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相似，但無(wú)抑癌基因p53的變異。CNS-1同樣是大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，表達(dá)膠質(zhì)瘤標(biāo)志物，比如GFAP，S100β等，及表現(xiàn)出人膠質(zhì)瘤的典型特征彌漫性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。9L和GL261來(lái)自小鼠的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，前者有p53突變和EGFR過(guò)表達(dá)，但不表達(dá)GFAP，也不表現(xiàn)為彌漫性侵入式生長(zhǎng)，因此認(rèn)為其為膠質(zhì)肉瘤。GL261表現(xiàn)為低分化的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。具有p53和K-ras 基因突變及PI3K/AKT活化等特征。這些細(xì)胞株不僅普遍應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的分子細(xì)胞生物學(xué)研究，也是異種細(xì)胞移植模型中普遍使用的細(xì)胞來(lái)源。

2 異種細(xì)胞移植

將腫瘤細(xì)胞注射入小鼠皮下（異位）或顱腔內(nèi)（原位）可以形成異位或原位膠質(zhì)瘤［9］。腫瘤細(xì)胞可以是來(lái)自化學(xué)誘變的膠質(zhì)瘤動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞系，也可以是膠質(zhì)瘤患者來(lái)源的腫瘤細(xì)胞。皮下異位移植操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，易觀察腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，適合研究腫瘤細(xì)胞的增殖行為。異位細(xì)胞移植失去腦部的環(huán)境特征，限制其在藥物研發(fā)中的作用，尤其是針對(duì)腫瘤微環(huán)境的藥物研發(fā)。原位膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植模型能較好的規(guī)避腫瘤微環(huán)境問(wèn)題。異種移植的另外一個(gè)缺陷是使用免疫缺陷的小鼠，阻礙對(duì)腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用的研究。人源化小鼠的研發(fā)與使用可以讓異種細(xì)胞移植模型更好的服務(wù)于腫瘤的基礎(chǔ)與藥物開發(fā)研究。該小鼠模型在膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)研究中廣泛使用，檢測(cè)或篩選新的基因或信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用［10-11］。

3 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

小鼠與人在遺傳與生理上存在多方面相似性，這是小鼠成為主要模式動(dòng)物的原因。隨著技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在可以在分子水平操作小鼠的基因組，包括不可傳代的體細(xì)胞轉(zhuǎn)染和可傳代的穩(wěn)定遺傳修飾。研究發(fā)現(xiàn)RTK/PI3K、p53和Rb信號(hào)異常是膠質(zhì)瘤發(fā)生與惡性進(jìn)展的核心通路，因此膠質(zhì)瘤小鼠模型主要是回繞這些核心通路構(gòu)建的。

3.1 IDH1R132H突變條件性敲入小鼠模型 異檸檬酸脫氫酶IDH是三羧酸循環(huán)中一個(gè)關(guān)鍵限速酶，包括IDH1、IDH2和IDH3三個(gè)亞型，催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸。人膠質(zhì)瘤中存在IDH1突變，主要是R132H突變，與患者預(yù)后相關(guān)［2，3，12］。在星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)瘤和繼發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，＞90%患者存在IDH1突變。與之相反，在原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，較少發(fā)生IDH1突變，表明IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。突變的IDH1獲得新的催化能力，將α-酮戊二酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成2-羥基戊二酸（2-HG）。代謝物2-HG可以抑制α-酮戊二酸依賴的與表觀遺傳有關(guān)的酶類（如 TET2，DNMT1），導(dǎo)致基因組 DNA 高度甲基化［13］。還可以通過(guò)抑制JAK活化，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生

［14］。最近的一項(xiàng)研究應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建了條件性IDH1突變（IDH1R132H）敲入小鼠模型［15］。在小鼠IDH1基因的外顯子3上引入R132H突變，并在外顯子2與3間的內(nèi)含子中插入包括loxP位點(diǎn)的IDH1小基因（mini-gene，包括野生型外顯子3～9序列，3'非翻譯區(qū)和polyA信號(hào)）。條件性突變敲入小鼠與Nes-CreERT2小鼠（Nestin基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre重組酶在神經(jīng)干/前體細(xì)胞特異表達(dá)，CreERT2為Cre的修飾形式，在他莫昔芬作用下發(fā)揮重組酶活性）雜交產(chǎn)生的后代成年后用他莫昔芬誘導(dǎo)可以在神經(jīng)干/前體細(xì)胞中表達(dá)突變的IDH1。分析發(fā)現(xiàn)該小鼠發(fā)生與膠質(zhì)瘤早期相似的病變［15］。表現(xiàn)為小鼠SVZ神經(jīng)干/前體細(xì)胞數(shù)目增加，SVZ細(xì)胞侵襲并發(fā)生異位增殖形成膠質(zhì)瘤前體灶。尤為重要的是，Wnt信號(hào)、端粒酶信號(hào)、細(xì)胞周期等活性增強(qiáng)及基因組DNA甲基化水平上升，且基因表達(dá)譜也與人膠質(zhì)瘤相近。IDH1突變敲入小鼠模型有力支持了IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤發(fā)生早期的關(guān)鍵作用。IDH1突變敲入小鼠的表型為神經(jīng)干細(xì)胞的不可控增殖，與臨床上膠質(zhì)瘤還是存在一定的差異，因此該小鼠模型適合于研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生與細(xì)胞起源，而不適合于膠質(zhì)瘤的治療藥物篩選。人膠質(zhì)瘤中，IDH1突變與P53突變共同發(fā)生，因此該小鼠組合p53基因敲除能否發(fā)生與人膠質(zhì)瘤病理更加接近的小鼠膠質(zhì)瘤值得進(jìn)一步研究。

3.2 p53/Nf1條件性雙敲除小鼠模型 p53是一個(gè)抑癌基因，在多數(shù)的腫瘤包括膠質(zhì)瘤中存在p53基因突變。Nf1（Neurofibromatosis type 1）也是一個(gè)抑癌基因，負(fù)向調(diào)控Ras信號(hào)，因此Nf1缺失導(dǎo)致Ras信號(hào)活化［16］。在小鼠中，僅敲除p53基因不能夠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤［17］。GFAP-Cre（Glial fibrillary acidic protein，在星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)Cre，）介導(dǎo)的p53/Nf1雙基因條件性敲除小鼠發(fā)生典型的膠質(zhì)瘤，存在偽柵欄樣（pseudopalisading）腫瘤細(xì)胞、壞死、小血管增生等典型特征［17］。該小鼠模型表明雙抑癌基因缺失足夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤，并存在低級(jí)別膠質(zhì)瘤向高級(jí)別膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展現(xiàn)象。與此類似的，GFAP-Cre介導(dǎo)的p53與另一抑癌基因PTEN組合缺失小鼠也發(fā)生膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［18］。抑癌基因雙缺失小鼠膠質(zhì)瘤模型是研究膠質(zhì)瘤發(fā)生中腫瘤細(xì)胞起源問(wèn)題的工具［19-20］，同時(shí)也可以用于膠質(zhì)瘤靶向藥物的研發(fā)。雖然p53與Nf1雙突變能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生類似人膠質(zhì)瘤病變，但在Nf1突變?cè)谌四z質(zhì)瘤中不常見(jiàn)，PDGFR或EGFR拷貝數(shù)增加引起Ras信號(hào)異常活化。

3.3 PDGF限制性過(guò)表達(dá)小鼠模型 PDGF/PDGFR信號(hào)屬于RTK信號(hào)，通過(guò)活化下游的PI3K/AKT和Ras/MAPK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抗凋亡能力。PDGF阻止膠質(zhì)前體細(xì)胞的分化，促進(jìn)其自我更新。高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在PDGFR基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象，表明PDGF/PDGFR信號(hào)在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。在GFAP或Nestin陽(yáng)性的神經(jīng)干細(xì)胞中通過(guò)病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)PDGF可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤，大部分為低級(jí)別少突膠質(zhì)瘤。這一小鼠模型表明小鼠膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞中自分泌過(guò)量PDGF足以誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤［21］。PDGF過(guò)表達(dá)加上抑癌基因INK4a-ARF敲除能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高級(jí)別膠質(zhì)瘤。INK4a-ARF基因通過(guò)mRNA剪接編碼兩個(gè)功能不同蛋白，分別是細(xì)胞周期抑制分子p16INK4a和p19ARF［22］。INK4a-ARF基因敲除小鼠自發(fā)產(chǎn)生多種腫瘤［23］。INK4a-ARF基因敲除還可以與EGFR活化突變過(guò)表達(dá)組合產(chǎn)生膠質(zhì)瘤樣病變［24］。INK4a-ARF基因敲除小鼠組合PDGF過(guò)表達(dá)膠質(zhì)瘤小鼠模型用于篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)CSF-1R阻斷增加膠質(zhì)瘤對(duì)RTK抑制劑的敏感性［25］。

PDGFB過(guò)表達(dá)是通過(guò)RCAS/tv-a系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。RCAS病毒載體是鳥逆轉(zhuǎn)錄病毒（avian sarcoma-leukosis virus-A，ASLV-A）RCAS/tv-a系統(tǒng)衍生載體，限制性感染帶有tv-a受體的鳥類細(xì)胞［26］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)tv-a受體，或通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法在小鼠特異細(xì)胞或組織中表達(dá)tv-a受體，能夠?qū)崿F(xiàn)RCAS載體攜帶的基因在特異細(xì)胞或組織中過(guò)表達(dá)。如在小鼠中，通過(guò)GFAP或Nestin基因的啟動(dòng)子在膠質(zhì)細(xì)胞或者神經(jīng)干細(xì)胞中特異表達(dá)tv-a受體的轉(zhuǎn)基因小鼠Gtv-a或Ntv-a，感染帶有EGFR或PDGFB的RCAS載體能夠在膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞中特異過(guò)表達(dá)EGFR或PDGFB。同樣，通過(guò)RCAS載體表達(dá)干擾RNA，也能夠?qū)崿F(xiàn)在小鼠特定表達(dá)t-va受體的細(xì)胞中敲降目的基因的表達(dá)。該系統(tǒng)在其它腫瘤的研究中也有應(yīng)用［27-28］。

3.4 其它小鼠 GFAP基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的癌基因在小鼠膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)也可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤，比如GFAP-vsrc轉(zhuǎn)基因小鼠中，GFAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Rous肉瘤病毒v-Src在小鼠膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)，可以使小部分小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤［29］。同樣GFAP基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的V-Ha-RAS轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生星形細(xì)胞瘤［30］。Src和Ras活化雖然能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤樣病變，但臨床上，Src和Ras基因突變并不常見(jiàn)，因此這兩種膠質(zhì)瘤小鼠模型目前已經(jīng)較少使用。

除RCAS/tv-a系統(tǒng)改變小鼠神經(jīng)細(xì)胞基因的方法外，最近也有研究把最新的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9引入小鼠膠質(zhì)瘤中［31-32］，簡(jiǎn)單快速的在小鼠神經(jīng)細(xì)胞中敲除一個(gè)或多個(gè)抑癌基因。CRISPR/Cas9也可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小鼠的制備，取代之前廣泛使用的胚胎干細(xì)胞中基因重組的方法。

4 展望

隨著新技術(shù)在臨床研究中的應(yīng)用，目前對(duì)膠質(zhì)瘤的分子病理已經(jīng)有較系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，世界衛(wèi)生組織也建議在分子基礎(chǔ)上對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行分型管理和治療。動(dòng)物水平的研究可以較好的驗(yàn)證這些基因變異在腫瘤發(fā)生與惡性進(jìn)展中的確切作用，補(bǔ)充了臨床研究。目前膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)研究多集中在成人膠質(zhì)瘤方向，而兒童膠質(zhì)瘤是兒童的主要腫瘤，與成人膠質(zhì)瘤有不同的基因突變和組化特征。兒童膠質(zhì)瘤的理解與治療的改善需要與之對(duì)應(yīng)的動(dòng)物模型的發(fā)展。

［1］ Brown TJ,Brennan MC,Li M,et al. Association of the Extent of Resection With Survival in Glioblastoma： A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol,2016,2(11)：1460-1469.

［2］ Diamandis P,Aldape KD. Insights From Molecular Profiling of Adult Glioma. J Clin Oncol,2017,35(21)：2386-2393.

［3］ Verhaak RG. Moving the needle： Optimizing classification for glioma. Sci Transl Med,2016,8(350)：314f-350f.

［4］ Reifenberger G,Wirsching HG,Knobbe-Thomsen CB,et al.Advances in the molecular genetics of gliomas-implications for classification and therapy. Nat Rev Clin Oncol,2017,14(7)：434-452.

［5］ Lenting K,Verhaak R,Ter Laan M,et al. Glioma： experimental models and reality. Acta Neuropathol,2017,133(2)：263-282.

［6］ Russell WL,Kelly EM,Hunsicker PR,et al. Specific-locus test shows ethylnitrosourea to be the most potent mutagen in the mouse. Proc Natl Acad Sci USA,1979,76(11)：5818-5819.

［7］ Zook BC,Simmens SJ,Jones RV. Evaluation of ENU-induced gliomas in rats： nomenclature,immunochemistry,and malignancy.Toxicol Pathol,2000,28(1)：193-201.

［8］ Stylli SS,Luwor RB,Ware TM,et al. Mouse models of glioma. J Clin Neurosci,2015,22(4)：619-626.

［9］ Misuraca KL,Cordero FJ,Becher OJ. Pre-Clinical Models of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Front Oncol,2015,5：172.

［10］ Wang J,Cheng P,Pavlyukov MS,et al. Targeting NEK2 attenuates glioblastoma growth and radioresistance by destabilizing histone methyltransferase EZH2. J Clin Invest,2017,127(8)：3075-3089.

［11］ Jung E,Osswald M,Blaes J,et al. Tweety-Homolog 1 Drives Brain Colonization of Gliomas. J Neurosci,2017,37(29)：6837-6850.

［12］ M GL,Boulay K,Topisirovic I,et al. Oncogenic Activities of IDH1/2 Mutations： From Epigenetics to Cellular Signaling.Trends Cell Biol,2017.

［13］ Yang Z,Jiang B,Wang Y,et al. 2-HG Inhibits Necroptosis by Stimulating DNMT1-Dependent Hypermethylation of the RIP3 Promoter. Cell Rep,2017,19(9)：1846-1857.

［14］ Jiang B,Zhang J,Xia J,et al. IDH1 Mutation Promotes Tumorigenesis by Inhibiting JNK Activation and Apoptosis Induced by Serum Starvation. Cell Rep,2017,19(2)：389-400.

［15］ Bardella C,Al-Dalahmah O,Krell D,et al. Expression of Idh1R132H in the Murine Subventricular Zone Stem Cell Niche Recapitulates Features of Early Gliomagenesis. Cancer Cell, 2016,30(4)：578-594.

［16］ Philpott C,Tovell H,Frayling IM,et al. The NF1 somatic mutational landscape in sporadic human cancers. Hum Genomics,2017,11(1)：13.

［17］ Zhu Y,Guignard F,Zhao D,et al. Early inactivation of p53 tumor suppressor gene cooperating with NF1 loss induces malignant astrocytoma. Cancer Cell,2005,8(2)：119-130.

［18］ Qi Q,Kang S S,Zhang S,et al. Co-amplification of phosphoinositide 3-kinase enhancer A and cyclin-dependent kinase 4 triggers glioblastoma progression. Oncogene,2017,36(32)：4562-4572.

［19］ Alcantara L S,Wang Z,Sun D,et al. Adult Lineage-Restricted CNS Progenitors Specify Distinct Glioblastoma Subtypes. Cancer Cell,2015,28(4)：429-440.

［20］ Liu C,Sage JC,Miller MR,et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell,2011,146(2)：209-221.

［21］ Dai C,Celestino JC,Okada Y,et al. PDGF autocrine stimulation dedifferentiates cultured astrocytes and induces oligodendrogliomas and oligoastrocytomas from neural progenitors and astrocytes in vivo. Genes Dev,2001,15(15)：1913-1925.

［22］ Quelle DE,Zindy F,Ashmun RA,et al. Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest. Cell,1995,83(6)：993-1000.

［23］ Serrano M,Lee H,Chin L,et al. Role of the INK4a locus in tumor suppression and cell mortality. Cell,1996,85(1)：27-37.

［24］ Holland EC,Hively WP,Depinho RA,et al. A constitutively active epidermal growth factor receptor cooperates with disruption of G1 cell-cycle arrest pathways to induce glioma-like lesions in mice.Genes Dev,1998,12(23)：3675-3685.

［25］ Yan D,Kowal J,Akkari L,et al. Inhibition of colony stimulating factor-1 receptor abrogates microenvironment-mediated therapeutic resistance in gliomas. Oncogene,2017.

［26］ Moore LM,Holmes KM,Fuller GN,et al. Oncogene interactions are required for glioma development and progression as revealed by a tissue specific transgenic mouse model. Chin J Cancer, 2011,30(3)：163-172.

［27］ Reddy JP,Li Y. The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo.J Mammary Gland Biol Neoplasia,2009,14(4)：405-409.

［28］ Kuzu OF, Nguyen FD, Noory MA, et al. Current State of Animal(Mouse)Modeling in Melanoa Research. Cancer Growth Metastasis, 2015,8(Suppl 1)：81-94.

［29］ Weissenberger J,Steinbach J P,Malin G,et al. Development and malignant progression of astrocytomas in GFAP-v-src transgenic mice. Oncogene,1997,14(17)：2005-2013.

［30］ Ding H,Roncari L,Shannon P,et al. Astrocyte-specific expression of activated p21-ras results in malignant astrocytoma formation in a transgenic mouse model of human gliomas. Cancer Res, 2001,61(9)：3826-3836.

［31］ Zuckermann M, Hovestadt V, Knobbe-Thomsen CB, et al.Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun, 2015,6：7391.

［32］ Bressan RB,Dewari PS,Kalantzaki M,et al. Efficient CRISPR/Cas9-assisted gene targeting enables rapid and precise genetic manipulation of mammalian neural stem cells. Development,2017,144(4)：635-648.

浙江省科技廳公益基金項(xiàng)目（2015C37114）

31007 杭州市中醫(yī)院（張祖勇）

31005浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)系（程洪強(qiáng)）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院（董曉巧 王昊 張仕蓉）