陳大可

蘆竹素對人前列腺癌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡及bcl-2/bax表達(dá)的影響

陳大可

目的：研究蘆竹素對人前列腺癌細(xì)胞系LNCap細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)理。方法：取對數(shù)生長期的LNCap細(xì)胞，分別用不同濃度的蘆竹素處理48 h后，用MTT細(xì)胞增殖法檢測細(xì)胞活力，Hoechst染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和周期，并用Western blot檢測LNCap細(xì)胞中Bcl-2和casepase家族蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：蘆竹素能以劑量依賴性方式降低LNCap細(xì)胞的活力，濃度為20、40、80 μg/mL的蘆竹素作用LNCap細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別增加至11.3%、25.2%、57.1%，明顯高于對照組（0.5%）；不同濃度的蘆竹素處理LNCaP細(xì)胞48 h后，G0/G1期細(xì)胞的比例增加，而G2/M期和S期的比例減少；蘆竹素處理組LNCap細(xì)胞Cleaved-caspase 3及Cleaved-caspase 9表達(dá)量增加，同時(shí)促凋亡蛋白Bax表達(dá)量增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量降低，且呈劑量依賴性。結(jié)論：蘆竹素能抑制LNCap細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制與上調(diào)Cleaved-Csepase 3，Cleaved-Casepase 9和Bax表達(dá)、下調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

前列腺癌；蘆竹素；凋亡；Bcl-2家族蛋白

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年發(fā)病率上升并呈年輕化的趨勢[1]。前列腺癌治療的傳統(tǒng)模式為外科手術(shù)加術(shù)后局部或全身的放療，但無論是手術(shù)技術(shù)和方法的改善或放射治療設(shè)備和技術(shù)的進(jìn)步，都沒有顯著提高前列腺癌患者的五年生存率。在臨床上前列腺癌的藥物治療主要用于不能手術(shù)治療或晚期患者的姑息治療，現(xiàn)有化學(xué)藥品如氟他胺片等對前列腺癌的臨床療效并不理想[2]，因此從天然產(chǎn)物中尋找抗癌活性成分是近年來研究的熱點(diǎn)[3-5]。

蘆竹素是中藥白茅根中特有的五環(huán)三萜類化合物（其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示）[6]，其生物活性研究較少。本研究旨在明確蘆竹素對前列腺癌LNCap細(xì)胞活力、凋亡及與細(xì)胞凋亡有關(guān)的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族和Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響，為揭示蘆竹素的抗腫瘤活性、作用機(jī)理以及臨床應(yīng)用前景提供扎實(shí)的理論依據(jù)。

圖1 蘆竹素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料 蘆竹素購于上海羽朵生物科技有限公司（純度≥95%）；人前列腺癌細(xì)胞系LNCap細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)所用的胎牛血清、青霉素、鏈霉素購于美國Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640購自上海元龍生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒購于上海哈靈生物科技有限公司；Hoechst 33258核酸染料購自北京泛博生化有限公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購于上海元龍生物技術(shù)有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）活性檢測試劑盒購于上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司；Bcl-2、Bax、casepase-3、casepase-9、GAPDH等抗體均購于上海哈靈生物科技有限公司；DMSO及其它化學(xué)試劑（分析純）購于北京試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LNCap細(xì)胞培養(yǎng)于為含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的PMI 1640培養(yǎng)液中。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件：37℃，5%CO2，濕度飽和。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活力抑制實(shí)驗(yàn) 取濃度為1×105/mL的LNCap細(xì)胞，接種于96孔板，每孔200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)至貼壁后實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入終濃度為20、40、60、80、100、120 μg/mL的蘆竹素，以同體積PMI 1640培養(yǎng)液為空白對照孔。每一濃度下均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以MTT法檢測細(xì)胞活力。

1.2.3 Hoechst 33258染色法檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

取濃度為1×105/mL的LNCap細(xì)胞，接種于96孔板，每孔200 μL，細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為20、40、80 μg/mL的蘆竹素，以同體積PMI 1640培養(yǎng)液為空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以磷酸鹽緩沖液清洗2次，先加入4%多聚甲醛室溫下固定15 min，以磷酸鹽緩沖液清洗2次，再加入1 mmol/L Hoechst 33258室溫下染色15 min，封片，置于熒光顯微鏡下，在波長340 nm處觀察。

1.2.4 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的檢測 取濃度為1× 106/mL的LNCap細(xì)胞，接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度分別為0、20、40、80 μg/mL的蘆竹素培養(yǎng)48 h，細(xì)胞經(jīng)過離心、固定后，加入Annexin V-FITC和PI，過濾后送流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的檢測。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量的檢測 LNCap細(xì)胞培養(yǎng)和處理同1.2.4。收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書的方法提取胞漿總蛋白、測定濃度行Western blot分析。主要步驟如下：LNCap細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌三次，用變性裂解液將細(xì)胞在冰上裂解30 min,收集裂解液離心20 min，取上清，測定并調(diào)整蛋白濃度。將蛋白樣品95℃水浴15 min，使蛋白質(zhì)充分變性后于相應(yīng)泳道中加入相同體積的樣品分別進(jìn)行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)至預(yù)先用甲醇活化的PVDF膜上。之后用5%（w/v）脫脂奶粉4℃封閉2～3 h，加入用封閉液稀釋好的一抗4℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗3次，每次10 min后, PVDF膜用封閉液稀釋好的二抗室溫孵育1 h后，洗滌，在膜上滴加ECL發(fā)光液在暗室中進(jìn)行X光膠片曝光。以GAPDH作為內(nèi)參來比較目的蛋白Bcl-2、Bax、casepase-3,casepase-9含量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘆竹素對LNCap細(xì)胞增殖的影響 用不同濃度的蘆竹素處理LNCap細(xì)胞48 h，可以降低LNCap細(xì)胞的活力，且表現(xiàn)出劑量依賴性（圖2）。

圖2 蘆竹素處理48 h后對LNCap細(xì)胞生長的抑制率

2.2 蘆竹素對LNCap細(xì)胞形態(tài)的影響 Hoechst 33258核酸染料是一種非嵌入性細(xì)胞核復(fù)染劑，活細(xì)胞或固定細(xì)胞均可從低濃度溶液中攝取該染料，從而使細(xì)胞核著色。顯微鏡下可見Hoechst 33258在與dsDNA結(jié)合后激發(fā)藍(lán)色的熒光。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示：經(jīng)不同濃度的蘆竹素處理后，LNCap細(xì)胞核濃縮聚集、碎裂，發(fā)出藍(lán)色熒光，且呈濃度依賴性（圖3）。由于Hoechst 33258具有膜通透性，因此正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞均可被Hoechst 33258著色，但是正常細(xì)胞核染色后為淡藍(lán)色，形態(tài)呈圓形；而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，碎片狀。經(jīng)過蘆竹素處理后，LNCap細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色熒光明顯增強(qiáng)，這說明蘆竹素使細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

圖3 Hoechst33258染色顯示蘆竹素可引起LNCap細(xì)胞凋亡（×200）

2.3 蘆竹素對LNCap細(xì)胞的凋亡作用 通過Annexin V-FITC和PI染色，我們發(fā)現(xiàn)蘆竹素能誘導(dǎo)LNCap細(xì)胞凋亡。如圖4所示，20、40、80 μg/mL的蘆竹素處理LNCap細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡比例（早期凋亡+晚期凋亡）分別為（11.3±2.6）%、（25.2± 6.4）%、（57.1±6.1）%，明顯高于對照組凋亡率（0.5± 0.1）%，且誘導(dǎo)凋亡的作用具有明顯濃度依賴性。

2.4 蘆竹素對LNCap細(xì)胞周期的影響 如表1所示，LNCap細(xì)胞經(jīng)過不同濃度蘆竹素（20、40、80 μg/ mL）處理48 h后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，而G2/M期與S期細(xì)胞比例減少。其中，80 μg/mL蘆竹素處理后，G0/G1期細(xì)胞比例由48.02%大幅度增至75.44%（P＜0.01），而S期細(xì)胞比例由37.73%降低至20.82%（P＜0.01），G2/M期細(xì)胞比例由14.36%降低至3.17%（P＜0.01）。結(jié)果說明蘆竹素使LNCap細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，正常的細(xì)胞增殖周期被抑制。

圖4流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC和PI雙染色顯示蘆竹素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

表1 蘆竹素處理后LNCap細(xì)胞周期的變化

2.5 蘆竹素對LNCap細(xì)胞內(nèi)caspase家族蛋白表達(dá)量的影響 如圖5所示，未用蘆竹素處理的LNCap細(xì)胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)量很低。而經(jīng)過蘆竹素（濃度分別為20、40、80 μg/ mL）處理48 h后，LNCap細(xì)胞cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)量呈濃度依賴地增加。

圖5 蘆竹素對LNCap細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)量的影響

2.5 蘆竹素對LNCap細(xì)胞Bcl-2家族蛋白表達(dá)量的影響 如圖5所示，蘆竹素處理LNCap細(xì)胞48 h后，隨著蘆竹素濃度的升高，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量下調(diào)。因此蘆竹素處理后的細(xì)胞中Bcl-2/Bax的比例顯著降低。

3 討論

前列腺癌過去一直被認(rèn)為是西方人特有的癌癥，其發(fā)病率和死亡率居西方社會老年男子的前一、二位。但是隨著平均壽命的提高和檢查設(shè)備的進(jìn)步，近年來國內(nèi)的病例也呈迅速增加的趨勢[7]。中藥白茅根具有涼血止血，清熱利尿的功效，臨床用于冶療血熱吐血，衄血，尿血，熱病煩渴，肺熱咳嗽，胃熱嘔吐，濕熱黃疸，水腫尿少，熱淋澀痛，是泌尿系統(tǒng)疾病的常用藥之一[8-9]。近年來對白茅根的化學(xué)成分研究主要集中在五環(huán)三萜類化合物上，其中蘆竹素是代表性的化合物，但是對其生物活性特別是抗腫瘤活性的研究較少[4]。本文首次報(bào)道了蘆竹素對前列腺癌細(xì)胞的作用及其可能的作用機(jī)理。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞維持穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境的機(jī)制之一，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，也是評價(jià)抗癌藥物有效性的重要指標(biāo)之一[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)蘆竹素在20～120 μg/mL濃度范圍能劑量依賴地降低人前列腺癌LNCap細(xì)胞的活力，且通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)蘆竹素處理LNCap細(xì)胞48 h后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且顯著量效關(guān)系。

caspase家族蛋白是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個(gè)重要共同點(diǎn)是活性位點(diǎn)都含有半胱氨酸，并特異地?cái)嚅_天冬氨酸殘基后的肽鍵。caspase家族蛋白的激活被公認(rèn)為是誘發(fā)凋亡的直接效應(yīng)物[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆竹素劑量依賴性地增加LNCaP細(xì)胞中caspase-3和caspase-9活性的表達(dá)和活化的caspase-9和caspase-3裂解。caspase-9裂解可能參與細(xì)胞凋亡的啟動、caspase-3裂解可能參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行，他們可以降解poly ADP-ribose polymerase（PARP），導(dǎo)致DNA修復(fù)和DNA降解的抑制作用。本研究結(jié)果表明，蘆竹素可能通過增強(qiáng)caspase的活性，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族是一個(gè)特殊的蛋白家族，成員中有一些（如Bad、Bid、Bax）可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有些成員（如Bcl-2、Bcl-w）則可以阻止細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。Bcl-2是一種內(nèi)膜蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，可以阻止細(xì)胞色素C的釋放，增強(qiáng)線粒體膜電位，抑制鈣離子釋放，阻止核酸內(nèi)切酶活化，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用；Bax的作用與Bcl-2相反，可促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活細(xì)胞凋亡效應(yīng)因子caspase，改變細(xì)胞膜通透性進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14-15]。細(xì)胞中Bcl-2和Bax比例的改變可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過蘆竹素處理48 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，因此Bcl-2與Bax的比值增加，這與蘆竹素的凋亡作用是正相關(guān)的。

綜上所述，蘆竹素能以劑量依賴性方式抑制LNCap細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax蛋白表達(dá)并下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，活化caspase-3和caspase-9有關(guān)。本研究為臨床應(yīng)用蘆竹素及白茅根制品治療前列腺癌提供了新的線索。

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（收稿：2016-09-26 修回：2016-10-20）

（責(zé)任編輯 張淑坤）

Effects of Arundoin on Cell Apoptosis and Expression of Bcl-2/Bax in Prostate Cancer Cells

CHEN Da-ke
Department of Urinary Surgery,Wenzhou Municipal People’s Hospital,Wenzhou（325000）,China

Objective To explore the effect of arundoin on cell apoptosis in human prostate cancer LNCap cells and the mechanism.MethodsLNCap cells were treated with arundoin in different concentration.The relative cell viabilities were determined by the MTT method,the morphological changes of cells were observed using Hoechst 33258 staining,and the apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry.At thesame time,the protein expressions of Bcl-2,Bax,caspase-3 and caspase-9 were detected by Western blot.Re?sultsArundoin(20-120 μg/mL)significantly inhibited the viabilities of LNCap cells in a dose-dependent man?ner.Hoechst 33258 staining showed that arundoin increased the membrane permeability of LNCap cells.Flow cy?tometry results showed that arundoin could induce apoptosis in LNCap cells,the apoptotic ratios were 11.3%(20 μg/mL),25.2%(40 μg/mL),57.1%(80 μg/mL),significantly higher than that of control group 0.5%(0 μg/mL). After different concentrations of arundoin treatment for 48 h,the proportion of LNCap cells in G0/G1 phase was increased,while the proportion of the G2/M phase and S phase were reduced.In 80 μg/mL arundoin treatment group,the proportion of cells in G0/G1 phase was increased significantly.The data of Western blot showed that arundoin(20,40,80 μg/mL)up-regulated the expression levels of cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,and Bax,but down-regulated Bcl-2,in a dose-dependent manner.ConclusionArundoin could inhibit the prolif?eration of LNCap cells and promote apoptosis,which may be associated with the down regulation of Bcl-2 ex?pression and up regulation of Bax expression,as well as the increase of relative activity of caspases.

Prostate cancer;arundoin;apoptosis;Bcl-2 family protein

R329.2+5；R737.25

A

1007-6948(2016)06-0575-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.06.016

溫州市人民醫(yī)院泌尿外科（溫州 325000）

陳大可,E-mail：cdk11777@163.com