王立妍，陳玉芳，王丹，汪濤

（1天津中醫(yī)藥大學護理學院，天津 300193；2天津醫(yī)科大學總醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300052；3天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，天津 300193）

當歸補血湯促進異體移植的肌衛(wèi)星細胞存活

王立妍1，陳玉芳1，王丹2，汪濤3*

（1天津中醫(yī)藥大學護理學院，天津 300193；2天津醫(yī)科大學總醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300052；3天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，天津 300193）

目的 應用原位雜交技術觀察當歸補血湯對移植肌衛(wèi)星細胞受體鼠造血功能重建的影響。方法 對4組受體鼠的骨組織石蠟切片進行原位雜交，探究Y染色體的存在及陽性細胞表達率。結(jié)果 除空白對照組，其余3組（移植肌衛(wèi)星細胞＋灌注生理鹽水組、移植肌衛(wèi)星細胞＋灌注等倍當歸補血湯組、移植肌衛(wèi)星細胞＋灌注5倍當歸補血湯組）均呈陽性反應，且陽性細胞表達率差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 原位雜交技術可以證明雌性小鼠骨組織中的Y染色體來自于雄性供體肌衛(wèi)星細胞，當歸補血湯干預有助于受體鼠造血功能重建，為后續(xù)研究提供進一步的實驗室依據(jù)。

原位雜交技術；當歸補血湯；肌衛(wèi)星細胞；Y染色體

隨著人們生活方式和環(huán)境的改變，人類的疾病譜也發(fā)生了相應的變化，血液系統(tǒng)疾病發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。肌衛(wèi)星細胞（muscle satellite cell，MSC）是一種靜止的成體干細胞，位于肌纖維膜與基膜之間，在誘導刺激下會活化成動態(tài)MSC，增殖和分化為多種細胞類型［1-2］。有研究者經(jīng)小鼠尾靜脈注射MSC，之后對小鼠骨髓單個核細胞進行化學染色并觀察脾結(jié)節(jié)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)早期會出現(xiàn)相對較多的造血細胞并且脾結(jié)節(jié)有增多現(xiàn)象，證實MSC具有造血重建的潛能［3］，為血液系統(tǒng)疾病患者臨床治療帶來新的希望。

當歸補血湯由黃芪和當歸兩藥以5：1配伍組成，多用于氣血虛、勞倦內(nèi)傷及陽浮于外之虛熱證。有研究表明，當歸補血湯具有改善造血微環(huán)境、刺激造血干細胞增殖分化、抑制造血干細胞凋亡和提高機體免疫力等調(diào)節(jié)和促進造血的作用［4］。

為了探討當歸補血湯是否能促進肌衛(wèi)星細胞移植的造血功能重建作用，本研究從同種異體雄性小鼠中提取出的肌衛(wèi)星細胞移植到照射后的雌性受體鼠內(nèi)，并協(xié)同不同劑量的當歸補血湯處理受體鼠后，應用原位雜交技術探查雌性小鼠骨髓Y染色體性別決定區(qū)（sex determining region of the Y，SRY）基因表達，為當歸補血湯預處理結(jié)合肌衛(wèi)星細胞移植治療血液病及其相關疾病提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)

無菌條件下取乳鼠后肢骨骼肌，剔除脂肪、筋膜等，剪碎組織塊，培養(yǎng)基沖洗后靜置，去上層液及飄浮組織。加入0.1%Ⅱ型膠原酶，37℃消化20min，再加入0.125%胰蛋白酶消化5min，后加入少許血清終止消化，1000r／min離心10min，棄去上清液，加入培養(yǎng)液吹打后，400目尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液離心，棄去上清液，加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸移入培養(yǎng)瓶中，差速1h后，吸上清液，計數(shù)后用于移植或以1×105個／cm2密度接種培養(yǎng)。2d后第一次換液。

2 氣血兩虛證小鼠模型制作及肌衛(wèi)星細胞移植

利用射線照射小鼠全身，造成血細胞數(shù)量下降和骨髓損傷，制作氣血兩虛證小鼠模型［5］。將受體小鼠裝入有機玻璃鼠盒內(nèi)，經(jīng)8Gy137Cs-γ射線全身一次性致死劑量照射15min。照射后4～6h，除對照組之外，其余小鼠經(jīng)尾靜脈輸注雄性供體鼠 MSC，移植后小鼠在無菌層流架內(nèi)飼養(yǎng)，水、飼料、墊料均經(jīng)高溫高壓消毒。

3 當歸補血湯水煎劑給藥

古方中當歸補血湯（Chinese angelica blood tonic，CABT）的總劑量為36g／d，根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量計算法”計算出小鼠臨床等倍用藥劑量和5倍用藥劑量。將中藥復方劑按照黃芪與當歸5：1的量浸泡于蒸餾水中，每克中藥加水6ml，浸泡30min；武火煮沸后，文火煎煮30min，過濾后收集煎液，原渣再加水煎煮40min，二煎每克加水4ml，過濾取煎液，兩者混合，4℃保存?zhèn)溆?。?MSC移植后對小鼠采取0.2ml藥量灌胃，共灌藥7次，其中等倍劑量組每毫升藥液含中藥0.675g，5倍劑量組每毫升藥液含中藥3.375g。

4 制片

取小鼠雙下肢，分離雙側(cè)股骨和脛骨，置于10%的甲醛溶液中固定24h，然后置于2%的硝酸溶液中過夜脫鈣完全；按常規(guī)步驟將標本放于不同濃度乙醇溶液和二甲苯中進行脫水、透明，石蠟包埋、連續(xù)切片（3～5μm）；將切片裱于多聚賴氨酸處理的載玻片上后進行原位雜交反應。

5 原位雜交

小鼠SRY DNA生物素標記（POD）原位雜交雙染色系統(tǒng)試劑盒由灝洋生物公司提供。根據(jù)使用說明進行以下操作。①標本脫蠟：二甲苯2次，100%無水乙醇2次，95%乙醇1次，75%乙醇1次，每次5min。②去除核酸表面蛋白質(zhì)，增加組織通透性：組織表面滴加3%H2O2去離子水，室溫10min（實驗室條件為20℃）。③消化酶充分消化：組織表面滴加SRY試劑B（復合消化工作液），放入濕盒，室溫孵育10min。④0.1mol／L TBS溶液（pH7.8）沖洗標本5次，每次5min；100℃ 0.1mol／L TBS溶液（pH 8.9）孵育 20min，后迅速以0.1mol／L冷TBS溶液（pH7.8）沖洗3次，每次5min（0℃洗滌）；0.2×SSC溶液沖洗1次，每次5min（0℃洗滌）。⑤雜交：滴加SRY試劑A（雜交工作液）覆蓋組織表面，放入濕盒，溫箱37℃孵育過夜。⑥雜交后的洗滌：2×SSC溶液37℃沖洗3次，每次孵育5min；0.2×SSC溶液，37℃沖洗3次，每次孵育 5min；0.1 mol／L TBS溶液（pH7.8），37℃沖洗5次，每次孵育2min。⑦封閉液封閉：滴加SRY試劑C（POD轉(zhuǎn)化劑）覆蓋組織，放入濕盒，37℃溫箱孵育45min。0.01mol／L PBS溶液沖洗 3次，每次洗滌5min。⑧顯色：SRY試劑F（DAB）顯色，光學顯微鏡下觀察至細胞內(nèi)胞質(zhì)陽性顏色與細胞外背景顏色對比度反差明顯時，蒸餾水洗終止反應（顯色時間約為20min）。細胞核顯棕黃色顆粒為陽性反應。⑨蘇木復染：標本浸入蘇木素10min，復染后流水振洗；置于鹽酸酒精中數(shù)秒，流水振洗；氨水返蘭，流水振洗。⑩標本脫水：75%乙醇1次，95%乙醇 1次，100%無水乙醇 2次，二甲苯2次，每次5min。中性樹膠封片保留。

6 統(tǒng)計學分析

應用Image Pro-Plus圖像分析軟件對雜交反應結(jié)果進行定量檢測（平均光密度），以SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

對小鼠骨髓進行SRY原位雜交顯示，未移植MSC的氣血兩虛證小鼠（Control組）骨髓SRY雜交反應為陰性（圖1A），移植MSC的氣血兩虛證小鼠（MSC組）骨髓內(nèi)可見少量SRY雜交反應陽性細胞，陽性細胞核內(nèi)可見棕黃色陽性反應產(chǎn)物（圖1B）。移植MSC＋灌注等倍當歸補血湯的氣血兩虛證小鼠（MSC＋CABT組）骨髓中SRY雜交反應陽性表達率較MSC組明顯增加，陽性反應增強（圖 1C，表1）。而在MSC移植＋5倍當歸補血湯組（MSC＋5× CABT組），SRY雜交反應陽性表達率最高，陽性反應產(chǎn)物平均光密度也最高（圖1D，表1）。

圖1　當歸補血湯對移植肌衛(wèi)星細胞氣血兩虛證小鼠骨髓SRY表達影響的原位雜交檢測。A，Control組；B，MSC組；C，MSC＋CABT組；D，MSC＋5×CABT組；箭頭示原位雜交反應陽性細胞；比例尺，12.5μmFig.1　In situ hybridization detection of the effect of CABT on the expression of SRY in the bone marrow of the MSC-transplanted mice with qi-blood deficiency.A，Control group；B，MSC group；C，MSC＋CABT group；D，MSC＋5×CABT group；arrows indicates in situ hybridization positive cells；scale bar，12.5 μm.

表1　當歸補血湯對移植肌衛(wèi)星細胞氣血兩虛證小鼠骨髓　SRY表達水平影響的比較Table 1　Comparison of the effects of CABT on the expression level of SRY in the bone marrow of the MSC-transplanted mice with qi-blood deficiency

討　論

SRY是Y染色體上特有的基因，不僅可以追蹤觀察移植細胞的存活、轉(zhuǎn)歸［6］，而且在細胞分化過程中都不會發(fā)生減弱和丟失現(xiàn)象，明顯優(yōu)于其它追蹤方法［7］。因此，本實驗采用SRY原位雜交方法來追蹤雌性受體鼠體內(nèi)的雄性肌衛(wèi)星細胞的存活、轉(zhuǎn)歸和功能狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氣血兩虛雌性小鼠移植MSC后，其骨髓內(nèi)檢測到SRY表達，證實了來源于雄性小鼠的肌衛(wèi)星細胞能在受體鼠體內(nèi)存活，并可能參與了雌性受體鼠的造血重建的過程。這表明肌衛(wèi)星細胞確具有重建造血的能力［8］。肌衛(wèi)星細胞可能通過改善受體鼠內(nèi)的微環(huán)境，使肌衛(wèi)星細胞充分轉(zhuǎn)化為造血細胞，以重建小鼠的造血功能。

當歸補血湯（CABT）多用于氣血虛、勞倦內(nèi)傷及陽浮于外之虛熱證，具有改善造血微環(huán)境、刺激造血干細胞增殖分化和提高機體免疫力等調(diào)節(jié)和促進造血等作用［9-10］。本研究中，在移植MSC的氣血兩虛雌性小鼠灌注CABT后，其骨髓內(nèi)SRY陽性表達率增高，表達水平上升，尤以灌注5倍CABT的小鼠更為明顯，說明CABT經(jīng)過補氣改善與血虛相伴的機體功能下降，進而達到誘導肌衛(wèi)星細胞有效分化的目的，從而促進氣血兩虛中血細胞的恢復［11］，即“氣能生血”，由此促進移植的MSC在骨髓內(nèi)存活、轉(zhuǎn)歸及增強造血功能重建的作用。

［1］王靜，宋新磊，崔煥先，等.骨骼肌衛(wèi)星細胞的特性及其增殖與分化的調(diào)控.細胞生物學雜志，2007，29（4）：497-502.

[2]Bentzinger CF,Wang YX,Dumont NA,et al.Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.EMBO Rep, 2013,14(12):1062-1072.

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Chinese angelica blood tonic promotes the survival of allograft muscle satellite cells

Wang Liyan1,Chen Yufang1,Wang Dan2,Wang Tao3*
（1College of Nursing，3College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193；2Department of Traditional Chinese Medicine，General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052）

Objective To study the effect of Chinese angelica blood tonic(CABT)on the hematopoietic reconstruction of muscle satellite cell(MSC)in allograft mouse by in situ hybridization.Methods:Y chromosomes were detected by In situ hybridization in paraffin sections of bone tissue from four groups of receptor female mice.Results:Except for the control group,Y chromosomes were detected in the other three groups(MSC＋normal saline,MSC＋equivalent CABT,MCS＋5 times of CABT),and the difference between control and CABT groups is of statistical significance.Conclusion:The Y chromosomes in the bone tissue of the female mice were identified from the MSCs of male donors by in situ hybridization,which confirmed that CABT facilitated hematopoietic reconstruction in the receptor mice.This provides a basis for further experimental study of CABT function.

In situ hybridization technology；receptor mice；muscle satellite cells；Y chromosome

Q462

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.008

2015-04-06

2016-09-02

國家自然科學基金項目（81273892）（81673732）

王立妍，女（1987年），漢族，助教

（To whom correspondence should be addressed）：wangtao6112＠163.com