袁靜萍，陳創(chuàng)，袁修學(xué)，高利昆，劉琳，何惠華，饒潔，閻紅琳*

（1武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科，武漢 430060；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，武漢 430060；3武漢科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065）

乳腺癌中 VEGF和 MMP9的免疫組織化學(xué)表達(dá)及其與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系

袁靜萍1，陳創(chuàng)2，袁修學(xué)3，高利昆1，劉琳1，何惠華1，饒潔1，閻紅琳1*

（1武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科，武漢 430060；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，武漢 430060；3武漢科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065）

目的 探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）的表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素及腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法 通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)VEGF和MMP9在230例乳腺癌組織芯片中的表達(dá)，比較二者表達(dá)的相關(guān)性并分析二者表達(dá)與臨床病理因素、腫瘤復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。結(jié)果

VEGF和MMP9在乳腺癌中的陽(yáng)性率分別為68.3%和55.2%，顯著高于癌旁組織；VEGF的表達(dá)與臨床分期密切相關(guān)，Ⅰ期乳腺癌患者中的VEGF陽(yáng)性率顯著低于Ⅱ期＋Ⅲ期；MMP9的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MMP9的陽(yáng)性率顯著高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，且隨著組織學(xué)分級(jí)的升高，其陽(yáng)性率也逐漸升高；MMP9的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈顯著正相關(guān)；MMP9與VEGF在復(fù)發(fā)組中的陽(yáng)性率均顯著高于未復(fù)發(fā)組，是乳腺癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。結(jié)論 乳腺癌組織中VEGF和MMP9的高表達(dá)是乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，檢測(cè)其表達(dá)對(duì)判斷乳腺癌術(shù)后預(yù)后具有重要意義。

乳腺癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；基質(zhì)金屬蛋白酶9；復(fù)發(fā)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)乳腺癌發(fā)病率逐漸上升并且呈年輕化發(fā)展的趨勢(shì)，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵因素，探討乳腺癌的生物學(xué)特性與其復(fù)發(fā)及預(yù)后的關(guān)系是乳腺癌研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解破壞以及新生血管的形成是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要條件［1］，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）是參與該過(guò)程最重要的兩個(gè)因子，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌組織中VEGF、MMP9的表達(dá)，并探討二者的表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

材料與方法

1 標(biāo)本資料

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院、武漢大學(xué)中南醫(yī)院、武漢市中心醫(yī)院病理科230例術(shù)前未行其他化療、放療及內(nèi)分泌治療、臨床病理資料完整的乳腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本并制作成組織芯片（2個(gè)芯片點(diǎn)／例）。230例患者全為女性，年齡29～78歲，中位年齡48.9歲。術(shù)后病理診斷主要為浸潤(rùn)性癌（浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌175例，浸潤(rùn)性小葉癌27例，其他28例）。組織學(xué)分級(jí)G1級(jí)37例，G2級(jí)135例，G3級(jí)58例。190例行改良根治術(shù)，36例行傳統(tǒng)根治術(shù)，4例行保乳手術(shù)。在臨床隨訪過(guò)程中，87例出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中8例廣泛轉(zhuǎn)移，9例局部復(fù)發(fā)，24例骨轉(zhuǎn)移，14例肺轉(zhuǎn)移，14例肝轉(zhuǎn)移，12例胸壁轉(zhuǎn)移，3例腦轉(zhuǎn)移，2例盆腔轉(zhuǎn)移，1例內(nèi)臟轉(zhuǎn)移。

2 免疫組織化學(xué)染色

應(yīng)用常規(guī)SP法，進(jìn)行VEGF和MMP9免疫組織化學(xué)染色。組織4μm連續(xù)切片，pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液隔熱高壓抗原修復(fù)。VEGF、MMP9抗體（均為即用型鼠抗人單克隆抗體）、SP法免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自DAKO公司，染色步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀

VEGF、MMP9免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色深度計(jì)分。在高倍鏡下（×40）每例均隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)5個(gè)視野，確定每個(gè)視野的陽(yáng)性率，取平均數(shù)，按下列計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，＞5%至25%為1分，＞25%至50%為2分，＞50%至75%為3分，＞75%為4分。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的著色深度：基本不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)積分相乘：≥1為陽(yáng)性，＜1為陰性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，VEGF、MMP9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及病理類型、VEGF、MMP9表達(dá)與乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的單因素分析采用χ2檢驗(yàn)，同時(shí)采用Logistic回歸分析乳腺癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，VEGF、MMP9的表達(dá)相關(guān)性分析采用 Spearman等級(jí)相關(guān)性分析法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)采用α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

1 乳腺癌中VEGF和MMP9陽(yáng)性表達(dá)率增高

VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒（圖1上）。230例乳腺癌中，157例VEGF呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為68.3%，而在癌旁組織中VEGF主要呈低表達(dá)或不表達(dá)，其中97例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為42.2%。MMP9也主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃色顆粒，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物分布不均勻（圖1下）。在230例乳腺癌中，127例MMP9呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為55.2%，而在癌旁組織中MMP9呈低表達(dá)或不表達(dá)，陽(yáng)性率為10.4%（24例）。VEGF和MMP9在乳腺癌表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于癌旁組織。

2 乳腺癌中VEGF和MMP9的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與乳腺癌患者的臨床分期密切相關(guān)，在臨床分期為Ⅰ期的乳腺癌患者中的陽(yáng)性率顯著低于Ⅱ期＋Ⅲ期，而與乳腺癌患者的年齡、是否絕經(jīng)、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（表1）。MMP9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與乳腺癌患者的組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，隨著組織學(xué)分級(jí)的升高，MMP9陽(yáng)性率也逐漸升高，且MMP9在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性率顯著高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，而與乳腺癌患者的年齡、是否絕經(jīng)、臨床分期無(wú)關(guān)（表1）。

3 乳腺癌中VEGF與MMP9的表達(dá)呈正相關(guān)

在230例乳腺癌組織中，VEGF陽(yáng)性的腫瘤組織MMP9也趨于陽(yáng)性，Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示MMP9與VEGF的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（γ＝0.194，P＜0.01）（表2），提示二者在乳腺癌中發(fā)揮協(xié)同作用。

圖1　乳腺癌組織及癌旁組織VEGF及MMP9的免疫組織化學(xué)表達(dá)。比例尺，100μmFig.1　Immunohistochemical staining of VEGF and MMP9 in breast cancer tissues and adjacent tissues.Scale bar，100μm

表1　VEGF、MMP9蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系Table 1　Expression of VEGF and MMP9 in breast cancer and its relationship with clinical pathological characteristics

表2　VEGF與MMP9表達(dá)的相關(guān)性Table 2　Correlation between VEGF and MMP9 expression

4 乳腺癌復(fù)發(fā)組VEGF與MMP9表達(dá)增強(qiáng)

按照術(shù)后5年內(nèi)是否復(fù)發(fā)將230例乳腺癌患者分為復(fù)發(fā)組（87例）和未復(fù)發(fā)組（143例）。單因素預(yù)后分析病理類型、VEGF和MMP9表達(dá)與乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性（表3），結(jié)果顯示復(fù)發(fā)組乳腺癌組織中MMP9及VEGF的陽(yáng)性率分別為77.0%（67／87）和79.3%（69／87），未復(fù)發(fā)組MMP9及VEGF的陽(yáng)性率分別為62.9%（90／143）及40.6%（58／143），復(fù)發(fā)組MMP9與VEGF蛋白表達(dá)均顯著高于未復(fù)發(fā)組，而乳腺癌病理類型與復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)（表3）。

表3　單因素分析　VEGF、MMP9的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系Table 3　Single factor analysis of the relationship between VEGF and MMP9 expression and tumor recurrence

Logistic回歸分析顯示 VEGF（OR＝1.973）、MMP9（OR＝5.618）是乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素（表4）。

表4　Logistic回歸分析 VEGF、MMP9的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系Table 4　Logistic regression analysis of the relationship between VEGF and MMP9 expression and tumor recurrence

討　論

腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療失敗和患者死亡的主要原因，其過(guò)程包括原發(fā)腫瘤部位細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)降解，血管新生，原發(fā)腫瘤細(xì)胞脫落，腫瘤細(xì)胞穿破細(xì)胞外基質(zhì)屏障向外侵襲，轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞通過(guò)靶點(diǎn)內(nèi)皮和基底膜，形成繼發(fā)性轉(zhuǎn)移灶［2］。因此，研究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于指導(dǎo)臨床預(yù)后復(fù)發(fā)具有重要意義。

在腫瘤轉(zhuǎn)移這一復(fù)雜過(guò)程中，腫瘤血管新生起到了重要作用。生理狀態(tài)下，血管新生始于胚胎期血管網(wǎng)絡(luò)的形成過(guò)程，在病理狀態(tài)下，當(dāng)受到低氧或炎癥刺激時(shí)，VEGF等促血管生成因子大量產(chǎn)生引起信號(hào)級(jí)聯(lián)，首先引起現(xiàn)存血管基底膜的分解，以便內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，在基底膜開(kāi)始分解后，血管內(nèi)皮細(xì)胞從基底膜分解處開(kāi)始向外生長(zhǎng)，局部大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞聚集形成有較強(qiáng)組織侵襲能力的新生血管芽的前體—足體環(huán)，從而促進(jìn)血管新生［3］。VEGF于1986年由Senger［4］實(shí)驗(yàn)室首先發(fā)現(xiàn)，是一類編碼23kD蛋白的促血管生成因子。VEGF有3種受體，分別為VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，其中VEGFR-1是血管生成的必要受體，VEGFR-2與早期成血管細(xì)胞發(fā)育有關(guān)，VEGFR-3影響血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成［5，6］。VEGF及其受體是公認(rèn)的介導(dǎo)新生血管形成的關(guān)鍵因素，研究顯示VEGF的高表達(dá)與腫瘤微血管密度、惡性程度及患者預(yù)后不良密切相關(guān)［5，6］。大量研究顯示VEGF對(duì)腦、肺、腎臟、骨等全身各組織器官血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和趨化有十分明顯的促進(jìn)作用［7-10］。乳腺癌的相關(guān)研究也顯示VEGF在浸潤(rùn)性乳腺癌中呈高表達(dá)，并與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11，12］，且高表達(dá)VEGF的患者更易發(fā)生復(fù)發(fā)［13］。在浸潤(rùn)性乳腺癌中，有研究發(fā)現(xiàn) VEGF蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌血管生成以及早期復(fù)發(fā)有一定關(guān)聯(lián)［14］。本研究中，VEGF在乳腺癌中的陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織，且與乳腺癌患者的臨床分期及5年是否復(fù)發(fā)密切相關(guān)，在復(fù)發(fā)組中VEGF的陽(yáng)性率顯著高于未復(fù)發(fā)組，是乳腺癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。有研究顯示將經(jīng)典的預(yù)后因素ER／PR、Her-2與VEGF聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)對(duì)乳腺癌的治療及預(yù)后判斷起到互補(bǔ)作用，有一定臨床應(yīng)用價(jià)值［15，16］。

血管新生是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，除了依賴于血管外促血管生成因子VEGF等的刺激外，還需要在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶的作用下進(jìn)行基質(zhì)的降解，進(jìn)而重塑血管并分化成熟形成穩(wěn)定的血管。尤其是毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)|(zhì)的降解和重塑最為關(guān)鍵，細(xì)胞外基質(zhì)是由細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子物質(zhì)，是阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要組織屏障，其降解和重塑對(duì)于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖及毛細(xì)血管管腔的形成必不可少［17］。MMPs是一組Zn2＋、Ca2＋依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶家族，幾乎能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)成分［18］。MMP9是MMPs家族最重要的成員。研究顯示，MMP9能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的VEGF表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)VEGF作用于其受體，從而誘導(dǎo)血管生成［19］。同時(shí)，VEGF也刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MMPs或通過(guò)調(diào)控MMPs及其抑制物基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）的平衡，從而激活基質(zhì)降解的瀑布式反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞的穿透變得更加容易，影響腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移［20］。因此，MMP9和VEGF在一定程度上互相促進(jìn)，共同推進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。有報(bào)道顯示，MMP9在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11，12，21］，本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組MMP9的陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織，組織學(xué)分級(jí)較高的患者M(jìn)MP9陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于組織學(xué)分級(jí)較低的患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)MP9陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者患者，提示MMP9高表達(dá)者乳腺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性均增高。此外MMP9與VEGF在乳腺癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示在誘導(dǎo)乳腺癌微血管生成過(guò)程中VEGF和MMP9可能具有協(xié)同作用，可能是MMP9通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)釋放基質(zhì)中VEGF促進(jìn)血管生成。

血管生成是早期腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和發(fā)展所必需的。研究顯示腫瘤組織中MMP9及VEGF的表達(dá)與復(fù)發(fā)密切相關(guān)，高表達(dá)MMP9及VEGF的腫瘤細(xì)胞更易于復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移［22］。有研究采用文獻(xiàn)計(jì)量分析法對(duì)近10年乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)650個(gè)乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因，其中關(guān)鍵基因87個(gè)，瓶頸基因44個(gè)，同為關(guān)鍵基因和瓶頸基因的有37個(gè)，而MMP9和VEGF就在這37個(gè)與復(fù)發(fā)最為密切相關(guān)的基因中［23］。本研究中5年乳腺癌復(fù)發(fā)組中MMP9與VEGF蛋白表達(dá)均顯著高于未復(fù)發(fā)組，且均是乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，提示二者在乳腺癌的轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)中起著重要作用，同時(shí)也提示VEGF及MMP9可以作為分子指標(biāo)用于指導(dǎo)乳腺癌預(yù)后及術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，我們的研究顯示VEGF和MMP9在乳腺癌中的高表達(dá)與乳腺癌的病理過(guò)程密切相關(guān)，二者在促進(jìn)血管新生方面起協(xié)同作用，檢測(cè)二者的表達(dá)對(duì)于指導(dǎo)術(shù)后復(fù)發(fā)具有重要意義。

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Immunohistochemical expression of VEGF and MMP9 in breast cancer and its relationship with tumor recurrence and metastasis

Yuan Jingping1,Chen Chuang2,Yuan Xiuxue3,Gao Likun1,Liu Lin1,He Huihua1,Rao Jie1,Yan Honglin1*
（1Department of Pathology，2Department of Breast and Thyroid Surgery，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060；3Medical college of Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430065，China）

Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and matrix metalloproteinase 9(MMP9)in breast cancer,and their correlation with the clinical symptoms,pathological changes,as well as tumor metastasis and recurrence.Methods Immunohistochemistry was performed to detect the expression of VEGF and MMP9 in a microarray of 230 cases of breast cancer.The correlation between the two and the relationship between their expression and the clinical pathological parameters as well as tumor recurrence of breast cancer were analyzed.Results The positive rates of VEGF and MMP9 in breast cancer were 68.3% and 55.2%respectively,which were remarkably higher than in para-tumorous tissues.The expression of VEGF was closely related to the TNM stage,the positive rate of VEGF in patients of stageⅠbeing significantly lower than that in patients of stageⅡandⅢ.The expression of MMP9 was significantly correlated with histological grading and lymph node metastasis.The positive rate of MMP9 was significantly higher in the group with than without lymph node metastasis,and it gradually increased with the rise of the histological grade. The expression of MMP9 was positively correlated with that of VEGF.The positive rates of MMP9 and VEGF in the recurrence group were significantly higher than in the group without recurrence,both being considered as the risk factors of breast cancer recurrence. Conclusion The high expression of VEGF and MMP9 in breast cancer is a risk factor of postoperative recurrence,and the detection of their expression is of great significance for evaluating prognosis.

Breast cancer；vascular endothelial growth factor；matrix metalloproteinase 9；recurrence

R737.9

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.010

2016-08-15

2016-10-10

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目（B2015350）；武漢大學(xué)自主科研項(xiàng)目（2042016kf0116）

袁靜萍，女（1974年），漢族，主任醫(yī)師

（To whom correspondence should be addressed）：honglin1229＠163.com